Udforskning af Guanggancao Dings virkningsmekanisme ved behandling af kastrationsresistent prostatakræft baseret på netværksfarmakologi og eksperimentel verifikation
Prostatakræft (PCa) er den mest almindelige ondartede tumor i det reproduktive system hos ældre mænd. Mange tidlige behandlinger med androgenmangel er effektive, men de fleste udvikler sig i sidste ende fra hormonfølsom prostatakræft til kastrationsresistent prostatakræft (CRPC). CRPC er en meget dødelig og invasiv prostatakræft. Mere end 84% af CRPC-patienterne vil opleve metastaser, og medianoverlevelsen er kun 20 måneder. Selvom der er kommet nye kemoterapimidler og endokrine lægemidler i de senere år, har disse kemoterapimidler mange bivirkninger, og endokrine lægemidler har resistensproblemer, som forkorter lægemidlets virkningstid. Derfor er det af stor betydning at finde nye lægemidler for at forsinke processen med kastrationsresistens og behandle CRPC.
Glabridin er en flavonoidforbindelse udvundet af lakrids, som har en bred vifte af biologiske aktiviteter såsom antiinflammatorisk, antioxidant, antitumor, neurobeskyttende og antiosteoporose. Det er rapporteret, at glycyrrhizin har en god effekt ved at hæmme tumorcelleproliferation og inducere apoptose i brystkræft, leverkræft, mavekræft og livmoderhalskræft. Den molekylære mekanisme for glycyrrhizin på CRPC er dog ikke fuldt ud forstået. Netværksfarmakologi er en kombination af farmakologi, computervidenskab og informationsnetværk baseret på systembiologi, der giver nye ideer til opdagelse og udvælgelse af lægemidler til komplekse sygdomme. For yderligere at undersøge Guanggancao Dings virkningsmekanisme på CRPC brugte vi netværksfarmakologi, molekylær docking og celleeksperimenter til at udforske dens virkningsmekanisme, hvilket giver reference til fremtidig grundforskning i lægemidler og kliniske anvendelser.

I de senere år er der sket betydelige fremskridt i behandlingen af prostatakræft med traditionel kinesisk medicin, især inden for CRPC. Kombinationen af traditionel kinesisk medicin med kirurgi eller kemoterapi har den effekt, at den reducerer tumorstørrelse, sænker PSA, reducerer tilbagefald og forlænger overlevelsestiden. Mange forskningsrapporter tyder på, at de aktive ingredienser i lakrids har en betydelig antitumoreffekt på CRPC. Gioti et al. fandt, at lakridsekstrakt (GGE) alene eller i kombination med doxorubicin har antiproliferative virkninger på androgenuafhængige prostatacancerceller (PC-3-celler) og kan fremme udtrykket af autofagirelaterede gener som LC3A, ULK1 og AMBRA1. Zhang et al. fandt, at isoliquiritigenin kan hæmme spredningen af prostatacancerceller (PC-3 og 22RV1), fremkalde apoptose, blokere G2/M-cellecyklussen og hæmme væksten af PC-3-xenotransplantater gennem in vivo-dyreforsøg. Lakrids udviser fremragende anti CRPC-aktivitet, og glycyrrhizin i lakrids er en af de mange flavonoider, der har tiltrukket sig stor opmærksomhed og har god anti-tumoraktivitet. Virkningsmekanismen for CRPC er værd at udforske yderligere.
Sammenlignet med traditionel farmakologi giver netværksfarmakologi et nyt perspektiv for udvikling af nye lægemidler. For bedre at forstå glycyrrhizins virkningsmekanisme på CRPC brugte vi netværksfarmakologiske metoder til at indsamle 683 mål for glycyrrhizin gennem databaser som TCMIO, TCMSP og PharmMapper. Vi fandt 55 vigtige mål for glycyrrhizin mod kastrationsresistent prostatakræft ved hjælp af Venn-diagramværktøjer og identificerede 10 kernemål som AKT1, TP53, ESR1, EGFR og ALB gennem PPI-proteininteraktionsnetværksanalyse. GO-berigelsesanalyse viste, at glycyrrhizin hovedsageligt regulerer cellemetabolisme og apoptose ved at regulere proteinphosphorylering, oxidationsreaktioner og cellecyklus. Molekylær docking viste endvidere, at glycyrrhizin har god dockingaktivitet med 10 kernemål. Det forudsiges, at glycyrrhizin kan opnå antitumoreffekter ved at regulere udtrykket af disse kernemålproteiner. Blandt disse kernemål har AKT1-proteinet den højeste dockingaktivitet. AKT1 er en af de vigtige regulerende faktorer i PI3K/AKT-signalvejen, der er involveret i forskellige biologiske processer i tumorer. I prostatakræft blev genetiske variationer og dysregulering af genekspression af PI3K/AKT-signalvejskomponenter påvist i op til 42% af primær prostatakræft og 100% af metastatiske prostatakræftprøver baseret på genom- og transkriptomprofiler. I tidlige undersøgelser blev det foreslået, at AKT-undertyper (AKT1, AKT2) kan fremme overgangen fra androgenfølsomt stadium til hormonrefraktært stadium i prostatakræft. På baggrund af grundforskning i behandling af CRPC-patienter har undersøgelser rapporteret, at knockout af AKT1/2 i kastrationsresistente prostatacancer-dyremodeller har reduceret in vivo- og in vitro-metastaser betydeligt. Det kan ses, at hæmning af ekspressionen af AKT1 kan forbedre overlevelsesprognosen for CRPC-patienter, og AKT1-hæmmere kan være en potentiel behandling for CRPC-patienter. Vores undersøgelse antyder teoretisk, at glycyrrhizin kan være en AKT1-hæmmer, men om glycyrrhizin kan blive en effektiv AKT1-hæmmer for CRPC-patienter, skal stadig verificeres yderligere eksperimentelt i fremtiden.
Resultaterne af KEGG-vejberigelsen viste, at PI3K/AKT-signalvejen og proteoglykaner var involveret i 105 relaterede signalveje, herunder kræft, prostatakræft, kemokinreceptoraktivering, endokrin resistens og resistens over for epidermal vækstfaktorreceptortyrosinkinasehæmmere (P<0,01). Blandt dem er phosphatidyl-3-kinase (PI3K)/serin-threonin-proteinkinase (AKT)-signalvejen den mest bekymrende. PI3K/AKT-signalvejen er involveret i regulering af cellulær metabolisme, vækst, proliferation, differentiering og proteinsyntese. Mutationer i PI3K/AKT-signalvejen er blevet påvist i mange humane tumorer. Forskningsdata viser, at op til 70% til 100% af patienter med fremskreden prostatakræft oplever dysregulering af PI3K-signalvejen. Og det blev konstateret, at PI3K/AKT-signalvejen spiller en vigtig rolle i udviklingen af hormonfølsom prostatacancer til kastrationsresistent prostatacancer, og dens virkningsmekanisme kan være relateret til reguleringen af androgenreceptorens (AR) signalvej, som kan tjene som en potentiel biomarkør for CRPC. På nuværende tidspunkt er inhibitorer relateret til PI3K/AKT-signalvejen, såsom AZD5363, gået ind i den kliniske forsøgsfase og har opnået betydelige terapeutiske effekter. Undersøgelse af hæmmere relateret til denne vej har betydelig værdi i behandlingen af CRPC.
Vi fandt desuden ved hjælp af CCK8-metoden, at glycyrrhizin kan hæmme spredningen af PC-3-celler betydeligt. Flowcytometri og DAPI-farvningseksperimenter viste, at det kan inducere celleapoptose, og et fald i celleantal og morfologisk krympning blev observeret under mikroskopet. Til screening af antitumorlægemiddelkoncentrationer fandt vi, at deres IC50 var lidt højere, hvilket er relateret til den semifleksible dockingmetode, der blev brugt til molekylær docking. Sammenlignet med fleksibel docking er bindingsenergien beregnet ved semifleksibel docking lavere. Som en naturlig antioxidant har glycyrrhizin desuden stærke antioxidanteffekter. Lavdosis naturlige antioxidanter viste imidlertid ikke god antitumoraktivitet i antitumoreksperimenter, mens højdosis naturlige antioxidanter har toksiske virkninger på celler, og dens specifikke mekanisme skal udforskes yderligere. Baseret på KEGG-signalvejen, der forudsiges af netværksfarmakologi, forudsiger vi, at den hæmmende effekt af glycyrrhizin på PC-3-celler hovedsageligt kan være relateret til PI3K/AKT-signalvejen. Yderligere Western blot-eksperimenter blev udført for at undersøge effekten af glycyrrhizin på ekspressionen af proteiner relateret til PI3K/AKT-signalvejen i PC-3-celler. Resultaterne viste, at glycyrrhizin kan hæmme fosforyleringsprocessen af AKT-proteiner betydeligt. I vores eksperiment blev det observeret, at glycyrrhizin kan hæmme ekspressionen af fosforyleret AKT-protein betydeligt, men den hæmmende effekt på ekspressionen af fosforyleret PI3K-protein var ikke som forventet. Efter gentagne gange at have justeret proteinbelastningskoncentrationen og -forholdet og strengt standardiseret operationen, viste proteinet stadig ikke signifikante effekter. Det vurderes, at årsagen kan være relateret til kvalitetsproblemet med selve p-PI3K-proteinet, som har lav styrke. På grund af begrænsede midler til denne undersøgelse erstattede vi dog ikke proteinerne fra andre produkter. I fremtidige eksperimenter vil vi analysere flere beslægtede proteiner fra denne vej for at verificere vores hypotese.
Sammenfattende analyserede og forudsagde denne undersøgelse den potentielle virkningsmekanisme for glycyrrhizin på kastrationsresistent prostatakræft gennem netværksfarmakologi og verificerede den yderligere gennem molekylær docking og in vitro-celleeksperimenter. Resultaterne viste, at glycyrrhizin kan hæmme proliferationen og inducere apoptose af PC-3-celler, og dens mekanisme er relateret til fosforyleringsprocessen af AKT-protein. Derfor spekulerer vi i, at dets anti CRPC-mekanisme hovedsageligt kan være gennem regulering af fosforylering af proteiner relateret til PI3K/AKT-signalvejen. Denne undersøgelse giver ikke kun forskningsidéer til at udforske den molekylære mekanisme for Guanggancao Ding i behandlingen af kastrationsresistent prostatakræft, men giver også en effektiv metode til udvikling og klinisk anvendelse af antitumorlægemidler, der indeholder flavonoider i lakrids.