Исследование сроков сбора урожая и противораковой активности различных сортов инжира на основе флавоноидных компонентов
Фикус карика (Ficus carica L.) - листопадное плодовое дерево умеренного климата, принадлежащее к роду Фикус семейства Морские (Moraceae). Оно произрастает в бассейнах рек Евфрат и Тигр и является одним из самых ранних одомашненных человеком фруктовых деревьев, история посадки которого насчитывает более 10000 лет. Было доказано, что флавоноиды являются потенциальным природным антиоксидантом с антибактериальным и противоопухолевым эффектом. Корни, стебли, листья и плоды инжира могут использоваться в медицине. В 1950-х годах Ульман предположил, что обработка кишечника животных наружным инжирным молоком может вызвать значительное повреждение капилляров, что в тяжелых случаях может привести к гибели животных; однако при пероральном приеме токсичность не наблюдается. Из фигового молока были выделены четыре активных компонента, два из которых вводились подкожно или внутривенно для подавления роста пересаженной саркомы у мышей. Впоследствии было подтверждено, что эмульсия инжира может значительно подавлять рост первичных клеток рака молочной железы у мышей, вызывать некроз раковых клеток, задерживать возникновение пересаженной аденокарциномы, миелоидной лейкемии, лимфосаркомы и саркомы, а также вызывать дегенерацию саркомы. В Китае Ванг и др. впервые сообщили, что экстракты корней, стеблей, листьев и плодов инжира (включая молодые и зрелые плоды) проявляют значительную ингибирующую активность в отношении саркомы S180, рака легкого, рака печени и асцитной карциномы Эрлиха. Водный экстракт инжира давали опухолевым мышам или раковым больным, что могло улучшить иммунную функцию подопытных. Таким образом, можно предположить, что препараты инжира могут быть использованы в качестве натурального и нетоксичного вспомогательного средства для облегчения боли пациентов, проходящих химио- и радиотерапию, и улучшения качества их жизни. Однако эффективные противораковые ингредиенты инжира до сих пор не выяснены. Такеучи и др. впервые предположили, что основным противораковым компонентом инжира является бензальдегид. Инь и др. считают, что противораковый эффект инжира является результатом совместного действия кумариновых соединений, бензальдегида и маломолекулярных ароматических соединений фуранового кольца, при этом бензальдегид является лишь одним из усилителей или органических активных молекул. Позже было обнаружено, что полисахариды инжира обладают противораковой активностью. Однако структура полисахаридов сложна, и их связь с противоопухолевым действием требует дальнейшего изучения. С другой стороны, привлекает внимание связь между флавоноидами и противораковыми свойствами. Шарада и др. предположили, что морин, флавоноид, содержащийся в инжире, может подавлять развитие рака толстой кишки у крыс, индуцированного 1,2-диметилгидразином (ДМГ). Последующие отчеты об этом исследовании отсутствуют. Из-за многочисленных сортов инжира листья плодов, созревающих на разных стадиях, могут иметь разные функции. Поэтому в данном исследовании были собраны листья трех сортов инжира с июля по ноябрь 2019 года, извлечены и очищены флавоноиды, а также изучена ингибирующая активность флавоноидов инжира на пролиферацию раковых клеток человека в разные месяцы. Был изучен механизм противоракового действия флавоноидов инжира, проанализирована связь между флавоноидными веществами и противораковой активностью, чтобы обеспечить теоретическую основу для применения и развития флавоноидов инжира в противораковой медицине.

Флавоноиды - это ряд соединений, состоящих из двух бензольных колец, соединенных тремя атомами углерода. Они имеют структуру C6-C3-C6, нерастворимы или плохо растворимы в воде и легко растворяются в органических растворителях, таких как метанол, этанол и этилацетат. Поэтому спиртовой экстракт инжира и даже инжирное вино содержат определенное количество флавоноидов и обладают противораковой активностью. Что касается противоопухолевого эффекта, Бай и др. использовали экстракт фигового этанола для внутрибрюшинного введения мышам с твердой опухолью S180 и обнаружили, что он оказывает значительное ингибирующее действие на рост саркомы, увеличивает индекс органа и повышает процент Т-лимфоцитов, предполагая, что экстракт фигового этанола может оказывать противоопухолевое действие путем усиления иммунной функции мышей с опухолью. Это самое раннее сообщение о том, что флавоноиды инжира подавляют опухоли животных. В этом эксперименте мы обнаружили, что флавоноиды из листьев инжира обладают значительной ингибирующей активностью в отношении пролиферации клеток рака желудка человека SGC-7901, но имеют относительно низкое влияние на пролиферацию клеток рака желудка BGC-823 и рака печени Hepg-2 (см. рис. 1). По противораковому эффекту листьев, собранных с разных сортов в разные месяцы, видно, что степень ингибирования флавоноидами клеток SGC-7901 наиболее высока у листьев сорта "Брауншвейг" в августе, в то время как у листьев других сортов и месяцев она относительно низкая (см. табл. 2). Похоже, что только флавоноиды из листьев инжира определенных сортов и месяцев оказывают значительное влияние на пролиферацию конкретных опухолевых клеток. Некоторые люди предположили, что этанольный экстракт кордицепса цикадового обладает самым высоким уровнем ингибирования пролиферации раковых клеток в SGC-7901. Результаты данного эксперимента схожи с этим. При увеличении концентрации флавоноидов в листьях инжира количество клеток рака желудка SGC-7901 уменьшалось, они становились более короткими и морщинистыми, постепенно отделялись от клеточной пластины, а их ингибирующее действие проявляло дозовый эффект (см. рис. 2). Это дает теоретическую основу для определения сроков сбора листьев инжира и разработки противораковых эффектов флавоноидов.
Мы впервые использовали проточную цитометрию для наблюдения за индукцией апоптоза клеток флавоноидами в листьях инжира (см. рис. 3). При концентрации флавоноидов 200 мк г/мл общая скорость апоптоза клеток составила 39,08%; когда концентрация достигла 1600 мк г/мл, общая скорость апоптоза достигла 83,60%. Исходя из этого, полулетальная концентрация флавоноидов инжира для клеток SGC-7901 составила 577 25 мк г/мл. Это похоже на полуингибирующую концентрацию 653 мк г/мл, предложенную Purnamasari et al. для клеток рака печени Huh7it в метанольном экстракте инжира. Они обнаружили, что метанольный экстракт из листьев инжира может подавлять пролиферацию раковых клеток печени, способствовать апоптозу и приводить к некрозу клеток. Апоптоз включает в себя активацию, экспрессию и регуляцию ряда генов, в основном включающих эндогенные митохондриальные пути и экзогенные пути регуляции рецепторов смерти. Снижение мембранного потенциала митохондрий является отличительным событием раннего митохондриально-зависимого апоптоза. Garc í a-Zepeda et al. продемонстрировали, что ресвератрол индуцирует снижение митохондриального мембранного потенциала в клеточных линиях рака шейки матки и способствует апоптозу раковых клеток. В этом эксперименте наблюдалось, что флавоноиды инжира снижали уровень митохондриального мембранного потенциала клеток рака желудка человека SGC-7901 (см. Рисунок 4). Это указывает на то, что флавоноиды в листьях инжира способствуют апоптозу, вызывая снижение уровня митохондриального мембранного потенциала в клетках SGC-7901.
Мы также проследили ингибирующий эффект флавоноидов в листьях инжира на клеточный цикл раковых клеток и обнаружили, что они в основном блокируют митоз клеток SGC-7901 в фазе S, а некоторые - в фазе G2 (см. Рисунок 5). Сообщалось, что капсаицин может блокировать клетки рака эндометрия в S-фазе и вызывать повышение уровня апоптоза. Согласно исследованиям, противораковый механизм капсаицина заключается в ингибировании экспрессии белков CDK2, CDK4 и CDK6 - киназ, зависящих от клеточного цикла. Искусственно синтезированные производные флавоноидных аминокислот также могут ингибировать фазу G2/M клеточного цикла рака желудка MGC-803, при этом снижая экспрессию антиапоптотического белка Bcl-2 и повышая экспрессию проапоптотического белка Bax, тем самым запуская апоптоз клеток. В данном эксперименте был проанализирован механизм ингибирования флавоноидами инжира апоптоза в клетках SGC-7901 на уровне мРНК. Мы обнаружили, что экспрессия генов CDK1, CDK2, CDK6 и CyclinD1 в клетках SGC-7901, обработанных флавоноидами листьев инжира, значительно снизилась, а экспрессия E2F1 увеличилась (см. Рисунок 6B). В различных опухолевых тканях CDK находятся в аномально активированном состоянии, и ингибирование экспрессии CDK может подавить неконтролируемую опухолевую пролиферацию. Кроме того, обработка листьев инжира флавоноидами повлияла на экспрессию генов-супрессоров опухолей P53 и Bax, а также онкогена Bcl-2 (см. Рисунок 6А). Среди этих трех генов Bax и Bcl-2 принадлежат к одному семейству генов. Bcl-2 способствует клеточному циклу, а Bax и Bcl-2 образуют димер белка, который антагонизирует активность последнего, тормозит клеточный цикл и вызывает апоптоз клеток. По имеющимся данным, флавоноиды из Тяньшаньского снежного лотоса могут повышать экспрессию CaEs-17Bax и понижать экспрессию Bcl-2 в клетках рака пищевода человека, тем самым вызывая клеточный апоптоз. Флавоноиды, обнаруженные в листьях инжира, способствуют экспрессии генов-супрессоров опухоли P53 и Bax, в то время как экспрессия гена-супрессора опухоли Bcl-2 подавляется. Это позволяет предположить, что индуцирующий апоптоз эффект флавоноидов листьев инжира на клеточную линию рака желудка SGC-7901 может быть достигнут путем регулирования экспрессии генов Bax, P53 и Bcl-2, связанных с апоптозом.
Для изучения специфических активных компонентов флавоноидов листьев инжира в подавлении пролиферации клеток рака желудка SGC-7901 мы отобрали три образца ("Бранрик" в августе, "Масютаофен" в сентябре и "Боджихонг" в сентябре) для качественного и количественного анализа методом LCMS/MS на основе различных ингибирующих эффектов флавоноидов листьев инжира на пролиферацию клеток рака желудка SGC-7901 человека в разные сорта и месяцы. В результате скрининга было получено 12 дифференциальных метаболитов, высоко коррелирующих со степенью ингибирования рака (см. табл. 3). Среди них наблюдается значительная положительная корреляция между противораковым действием нарциссина и флавоноидов инжира. Сообщалось, что нарциссозид обладает противовирусной активностью, а также имеет большое значение для профилактики и лечения заболеваний, связанных с конформацией белка, таких как болезнь Альцгеймера, диабет II типа, болезнь Паркинсона и др. Недавно было высказано предположение, что нарциссозид может быть использован для профилактики и лечения COVID-19. Однако, обладает ли он противораковым действием, еще предстоит изучить. Результаты, приведенные в таблице 3, также указывают на значительную корреляцию между изокверцетином и противораковым действием флавоноидов инжира. Сообщалось, что изокверцетин может значительно подавлять экспрессию miR-23a в ткани глиомы, тем самым подавляя пролиферацию раковых клеток. Поэтому связь между изокверцетином в листьях инжира и противоопухолевой активностью заслуживает дальнейшего изучения. В-третьих, меланин способен подавлять рост опухолевых клеток и происходит это в S-фазе клеточного цикла. Но некоторые также считают, что блокада происходит в фазе G2/M. В этом исследовании также было обнаружено наличие меланина, а коэффициент корреляции между его содержанием и противораковой активностью составил r=9923, P=0,08. Хотя этот показатель не достиг уровня 0,05, он очень близок к нему. Более того, мы заметили, что флавоноиды из листьев инжира ингибировали клеточный цикл клеток SGC-7901 в фазе S. Это сходно с предыдущими результатами. Поскольку инжир относится к роду Ficus семейства Moraceae, стоит продолжить изучение вопроса о том, связано ли это флавоноидное вещество с противораковой активностью инжира. Кроме того, мы отметили, что содержание 6-дигидроксибензойной кислоты, ваниллофенона, цианидин-3-О-рутинозида хлорида, антоцианов, эпикатехина, синапина и др. значительно коррелирует с противораковой активностью флавоноидов инжира (см. табл. 3). Сообщалось, что катехины оказывают ингибирующее действие на рак печени человека. Однако в данном эксперименте мы наблюдали, что ингибирующий эффект флавоноидов листьев инжира на рак печени HepG-2 был относительно низким (см. рис. 1), что позволяет предположить, что ингибирующий эффект на SGC-7901 может быть не связан с эпикатехином. О связи между другими метаболитами и противораковым действием в настоящее время сообщается редко.
В этой статье впервые проанализирована ингибирующая эффективность флавоноидов на пролиферацию различных линий раковых клеток в листьях трех сортов, включая 'Branrick', 'Masyutaofen' и 'Bojihong', в период с июля по ноябрь. Было обнаружено, что сорт инжира 'Branrick' обладал самым высоким уровнем ингибирования флавоноидов в отношении рака желудка SGC-7901 в августе. При увеличении концентрации флавоноидов плотность и адгезия раковых клеток снижается, количество живых клеток уменьшается, а доля мертвых клеток и поздних апоптотических клеток увеличивается. Исследования механизма ингибирования рака показали, что флавоноиды из листьев инжира блокируют клеточный цикл в фазе S и в небольшом количестве в фазе G2. Митохондриальный мембранный потенциал клеток значительно снижается, а уровни экспрессии проапоптотических генов Bax и p53, а также гена E1F2, регулирующего клеточный цикл, значительно повышаются. Уровень экспрессии антиапоптотического гена Bcl-2, а также генов, связанных с клеточным циклом, Cy-clinD1 и CDKs, значительно снижается. Это важные механизмы, с помощью которых флавоноиды листьев инжира способствуют апоптозу раковых клеток. Кроме того, с помощью технологии LC-MS/MS и соответствующих анализов мы выявили несколько дифференциальных метаболитов, высоко коррелирующих с показателями ингибирования рака, таких как нарциссин, изорамнозид и пигмент шелковицы. Это открывает новые горизонты для разработки противораковых препаратов из листьев инжира в будущем.