Исследование индуцированной лейкаменином Е перестройки цитоплазматического цитоскелета и ингибирования миграции в клетках рака шейки матки человека HeLa
Микрофиламенты, микротрубочки и промежуточные волокна в эукариотических клетках соединены со своими связывающими белками и образуют высокоупорядоченную трехмерную сеть, подобную цитоплазматическому скелету. Они участвуют в ключевых процессах жизнедеятельности клеток, таких как транспорт материала, передача информации, деление клеток, клеточная миграция и поддержание клеточной морфологии. Динамический процесс цитоскелета строго регулируется для обеспечения жизнедеятельности клеток, и нарушение его сборки может привести к торможению клеточного роста, остановке деления и даже апоптозу клеток. Некоторые противоопухолевые препараты могут нарушать динамический баланс микротрубочек, изменяя деполимеризацию и полимеризацию цитоскелета, тем самым подавляя пролиферацию клеток и оказывая противоопухолевое действие. Противораковые препараты растительного происхождения - алкалоиды катарантуса и таксаны - могут соединяться с β - тубулином, вмешиваться в динамический процесс скелета микротрубочек и использоваться для лечения различных опухолей, включая рак молочной железы, рак легких, нейробластому, рабдомиосаркому, острый лейкоз и т.д. Исследование и открытие противоопухолевых препаратов, направленных на цитоскелет и связанные с ним белки, стало очень активной областью исследований.

Реактивные формы кислорода (ROS) выступают в роли сигнальных молекул внутри клеток и участвуют в основных клеточных жизненных процессах, таких как пролиферация и дифференцировка клеток. Вследствие изменения метаболических путей в опухолевых клетках повышается содержание ROS, особенно H2O2, что делает опухолевые клетки более чувствительными к изменениям уровня ROS. Поэтому специфические изменения внутриклеточных компонентов в результате генерации ROS и антиоксидантной защиты были определены как мишени для лечения рака. Исследования показали, что ROS, генерируемая NADPH-оксидазой и другими источниками, может непосредственно модифицировать микрофиламенты, микротрубочки и промежуточные белки шелка, влияя на процессы их динамической сборки-разборки, или изменять форму цитоскелета путем активации Rho GTPase в верхнем течении через соответствующие сигнальные пути. Опосредованный NADPH-оксидазой внутриклеточный окислительный стресс также играет важную регуляторную роль в заболеваниях, связанных с цитоскелетом. В последние годы исследователи проявляют широкий интерес к участию ROS в регуляции динамики цитоскелета.

В Китае произрастает более 90 видов растений рода Camellia, из которых около 30 используются в лечебных целях. Среди них Isodon rubescens был включен в Китайскую фармакопею и в основном используется для лечения антибактериальных, противовоспалительных и противоопухолевых заболеваний. Оридонин, являющийся основным действующим веществом Lonicera japonica, был тщательно изучен на предмет противоопухолевого механизма, а его структурные модификации вошли в I фазу клинических испытаний в качестве противолейкозных препаратов. Было обнаружено более 1300 видов энантиомерных дитерпенов каэмпферола, особенно много которых содержится в ветвях и листьях растений рода Camellia. Эти соединения проявляют широкую противораковую активность и, как ожидается, приведут к открытию новых противоопухолевых препаратов. В настоящее время только очень небольшое количество энантиомерных дитерпенов, таких как арбутин, были широко и систематически изучены на предмет их противораковых механизмов. Исследований других дитерпенов этого типа по-прежнему не хватает, однако в последние годы был достигнут значительный прогресс. В последние годы было обнаружено, что некоторые энантиомеры дитерпенов каэмпферола могут воздействовать на цитоскелетную систему и проявлять противораковую активность. Например, бактериоцин А непосредственно нацелен на белок BubR1 и активирует контрольную точку сборки веретена, предотвращая переход от среднего к позднему клеточному переходу и ингибируя митотическую фазу лейкозных клеток Raji и Jurkat; Вангзаозин А и эпинодозин вызывают перестройку цитоскелета (микрофиламентов, микротрубочек и промежуточных филаментов) в клетках HeLa и HL-60 соответственно, что связано с индукцией клеточной дифференцировки; лейкаменин Е также может вызывать фосфорилирование кератина в клетках HUVECs и PLC, тем самым блокируя нормальную сборку сети кератиновых волокон. В этой статье мы продолжаем рассказывать о влиянии лейкаменина Е на перестройку трех скелетных волокон (микрофиламентов, микротрубочек и кератиновых волокон) в клетках HeLa, а также о возможных механизмах ингибирования роста и миграции клеток. Это дает ключ к выяснению молекулярных механизмов противоракового действия энантиомерных дитерпеноидов каэмпферола и научную основу для дальнейшего развития и применения этого соединения.

В последние годы противораковая фармакологическая активность энантиомерных дитерпенов каэмпферола вызывает широкий интерес исследователей. Появляется все больше сообщений о механизмах противоракового действия этих соединений с различной молекулярной конфигурацией, и выясняется, что их влияние на клеточные жизненные процессы многогранно, демонстрируя многоцелевые эффекты на молекулярном уровне. Например, вызывая апоптоз и дифференциацию клеток через различные клеточные сигнальные пути; воздействуя на пероксидазы I и II, белок BubR1 и раковый белок AML1-ETO, он может регулировать активность NADPH-оксидазы и вызывать фосфорилирование кератина. Наша исследовательская группа последовательно изучала влияние энантиомерных дитерпенов каэмпферола на систему цитоскелета: лейкаменин E может вызывать фосфорилирование клеточного кератина K8 и K18 и ингибировать сборку кератина; эпинодозин и вангзаозин A могут соответственно влиять на динамическую сборку цитоскелета в клетках HL-60 и HeLa, вызывая перестройку цитоплазматического цитоскелета, изменяя распределение микрофиламентов, микротрубочек и промежуточных волокон скелета, нарушая гомеостаз цитоплазматической цитоскелетной системы. Однако механизмы их действия изучены недостаточно хорошо.

В этой статье мы впервые исследовали особенности перестройки цитоскелета клеток HeLa, вызванной низкими концентрациями лейкаменина Е (0,4-1,0 мк моль/л). Низкие концентрации лейкаменина Е значительно изменяли морфологию клеток после длительной обработки (48 и 72 ч), приводя к образованию длинных полос, значительному уменьшению числа псевдоподий, удлинению псевдоподий и значительному изменению ядерной морфологии с увеличением числа "почкообразных ядер". Как известно, микрофиламенты, микротрубочки и средние волокна выполняют функцию поддержания морфологии клеток и их ядер. Таким образом, эти изменения позволяют предположить, что лейкоменен Е может нарушать динамический баланс цитоскелета и вызывать его перестройку. Дальнейшее флуоресцентное окрашивание подтвердило это предположение: количество цитоплазматических стрессовых волокон уменьшилось, микротрубочки и кератиновые волокна собрались вокруг ядра, расположение микротрубочек и кератиновых промежуточных волокон значительно изменилось, а некоторые микротрубочки и кератиновые промежуточные волокна утолщились. Анализ методом проточной цитометрии также подтвердил уменьшение количества когезивных микрофиламентов, значительное увеличение количества агрегированных микротрубочек и незначительное увеличение полимеризации кератиновых волокон в клетках HeLa. Этот результат аналогичен нашему предыдущему сообщению об индукции перестройки цитоскелета в клетках HeLa энантиомерным дитерпеноидом вангзаозином А. Однако обработка клеток HepG2, H1299, PLC и HUVEC лейкаменином Е в высоких концентрациях (2,0~4,0 мк моль/л) в течение 24 часов привела к минимальным изменениям в морфологии клеток, что полностью отличается от картины изменений, наблюдаемых после обработки низкими концентрациями. Мы обнаружили, что высокие концентрации лейкоменена Е могут активировать сигнальный путь ERK в клетках, вызывать фосфорилирование K8-S431/73 и K18-S52, ингибировать сборку кератиновых волокон и уменьшать количество кератиновых волокон. Это указывает на то, что различные концентрации лейкоменена Е могут участвовать в регулировании различных сигнальных путей в клетках, вызывая различные клеточные реакции.

Глубокое участие цитоскелета в делении и миграции клеток тесно связано с клеточным канцерогенезом и деградацией. Динамическая сеть волокон, состоящая из цитоскелета и регуляторных белков, вовлечена в процесс клеточной миграции, проявляющийся в непрерывном изменении морфологии клеток, реорганизации цитоскелета и направленном движении клеток. Соединения, направленные на цитоскелет, такие как цитохалазин, колхицин и винкристин, ингибируют пролиферацию и миграцию клеток, воздействуя на сборку цитоскелета. Наши исследования показали, что 0,8~1,0 мк моль/л лейкоменена Е может нарушать динамический баланс цитоскелета клеток HeLa, вызывая значительную перестройку цитоплазматического цитоскелета, тормозя миграцию клеток и снижая скорость их пролиферации за счет блокирования клеточного цикла. Это указывает на то, что лейкоменен Е имеет важное значение для исследования и открытия новых противораковых препаратов.

ROS - это тип кислородсодержащих свободных радикалов, образующихся в живых организмах, более активных, чем молекулярный химический кислород, таких как O2, H2O2, - OH и др. В нормальных физиологических условиях ROS играет важную роль в качестве второго мессенджера, определяющего судьбу клетки и изменяющего различные сигнальные молекулы. Исследования подтвердили, что ROS участвует в сигнальном пути ремоделирования цитоскелета, непосредственно изменяя цитоскелет или белки, связанные с цитоскелетом, и является важным регуляторным фактором, участвующим в структуре и функции цитоскелета. Ранее мы сообщали, что лейкоменен Е может повышать уровень внутриклеточной ROS и индуцировать дифференцировку клеток HL-60 в зрелые гранулоциты путем регулирования активности NADPH-оксидазы в клетках HL-60. В данном исследовании обработка клеток HeLa 0,4~1,0 мкмоль/л лейкоменена Е значительно повышала уровень внутриклеточной ROS, причем содержание ROS значительно увеличивалось при повышении концентрации препарата и увеличении времени обработки. Мы предполагаем, что ROS может быть предшественником морфологических изменений клеток, торможения клеточной миграции и перестройки цитоскелета, вызванных лейкоменом Е. Лейкоменен Е может регулировать перестройку цитоскелета через сигнальный путь ROS, что приводит к изменению морфологии клеток и ингибированию их миграции. Дальнейшие эксперименты подтвердили высказанные предположения: добавление NAC оказало значительное ингибирующее действие на морфологические изменения, индуцированные лейкомененом Е (в сторону удлинения и уменьшения удлиненных псевдоподий), также было замечено, что NAC ослаблял индукцию сокращения стрессовых волокон лейкомененом Е и уменьшал агрегацию микротрубочек и кератиновых волокон вокруг ядра. Эти явления указывают на то, что перестройка цитоскелета и изменения в морфологии клеток, вызванные лейкомененом Е, связаны с повышением уровня ROS. Исследования показали, что ROS участвует в динамических процессах агрегации и деполимеризации микрофиламентов. В примитивных хондроцитах человека повышение уровня ROS способствует окислительной модификации Racl и вызывает изменения в структуре цитоскелета актиновых клеток; ROS нарушает сеть стрессовых волокон и другие пучки микрофиламентов клеток Сертоли яичек (СК) через ERK-путь. Кроме того, ROS существенно влияет на динамическую нестабильность микротрубочек, регулирует цитоскелетную организацию белков микротрубочек и вызывает модификацию белков микротрубочек. О взаимосвязи и механизме взаимодействия ROS и полимеризации кератиновых волокон нет соответствующих сообщений. Мы предполагаем, что перестройка цитоскелета, вызванная лейкаменином Е, происходит в результате активации сигнальных путей, связанных с перестройкой цитоскелета, через повышение уровня ROS, но для подтверждения конкретного пути необходимы дальнейшие исследования. Lai et al. сообщили, что нарингин вызывает повышение уровня ROS в клетках HeLa, активирует путь ROS/JNK/Bcl2 и ингибирует пролиферацию и миграцию клеток. Наше исследование подтверждает, что ROS могут действовать как сигнальные молекулы на цитоскелетную систему, нарушая согласованную реорганизацию цитоскелета во время движения клеток, что приводит к ингибированию клеточной миграции. Необходимы дальнейшие углубленные исследования сигнального пути, через который лейкаменин Е ингибирует клеточную пролиферацию.