Distribution des bactéries endophytes et criblage préliminaire des souches productrices de saponines stéroïdiennes dans le Xiangmaidong à différents stades de croissance
Le Xiangmaidong, également connu sous le nom de Hubei maidong Liriope spicata var. prolifera Y.T. Ma, est l'une des plantes sources du Shanmaidong dans la Pharmacopée de la République populaire de Chine (édition 2010). Les saponines stéroïdiennes constituent son principal ingrédient actif, et son squelette de base sapogénine appartient au dérivé du spirostane (composé de 27 atomes de carbone). Selon la configuration C25 de la structure du spirostane et l'état cyclique de l'anneau F, il peut être divisé en quatre types principaux : le spirostanol (C25 de configuration S), l'isostanol (C25 de configuration R) et le furostanol (l'anneau F est un dérivé à chaîne ouverte), les alcools de spirostanol modifiés (l'anneau F est un anneau tétrahydrofurane à cinq membres). Quatorze types de saponines stéroïdiennes ont été isolés à partir d'Ophiopogon japonicus, les principaux glycosides étant la diosgénine et la ruscogénine, qui sont tous deux des isomères C25 (S). La teneur en saponines C (Ls-S3) d'Ophiopogon japonicus est relativement élevée. Les saponines stéroïdiennes ont de multiples activités pharmacologiques et, à l'exception de quelques-unes qui peuvent être synthétisées chimiquement, elles sont principalement obtenues directement à partir de matières médicinales traditionnelles chinoises par extraction chimique. Les saponines stéroïdes de Xiangmaidong ne font pas exception. Toutefois, en raison de problèmes tels que les longs cycles de production, les obstacles à la culture continue dans les champs, la faible teneur en saponines, les coûts d'extraction élevés et la pollution environnementale importante, la production et l'approvisionnement durables en saponines stéroïdiennes de Xiangmaidong sont limités. Il est donc nécessaire de rechercher de nouveaux moyens de préparer les saponines en grandes quantités.

Des études antérieures ont fait état de l'isolement de bactéries endophytes capables de produire des saponines stéroïdiennes dans les bâtiments de Dianzhong et de Huazhong. Inspirée par ces études, notre équipe de recherche a tenté d'isoler et de découvrir des souches bactériennes endophytes qui métabolisent et produisent des saponines stéroïdiennes à partir de Xiangmaidong. En utilisant des méthodes de culture pure et la technologie 16SrDNA-PCRDGGE, nous avons analysé et identifié la distribution des bactéries endophytes dans des échantillons (tubercules ou racines) de Xiangmaidong au cours de son apparition initiale, de son expansion rapide et des périodes de récolte à maturité. Parallèlement, des méthodes de réaction colorée, de TLC et de HPLC ont été utilisées pour évaluer de manière préliminaire la capacité de production de saponines des souches cultivées pures obtenues, afin d'obtenir les souches cibles et de fournir un soutien théorique à la production "en usine, à grande échelle et rapide" de saponines stéroïdiennes.

En utilisant des méthodes traditionnelles de culture microbienne pure, cette étude a permis d'isoler 15 genres et 22 espèces de bactéries endophytes à partir des tubercules et des racines fibreuses de Xiangmaidong à différents stades de croissance. Parmi eux, il y avait 4 espèces de Bacillus et 4 espèces de Staphylococcus, 2 espèces de Pseudomonas, et les 12 genres restants, y compris Salmonella, Enterobacter, Pseudoxanthomonas, Morganella, Agrobacterium, Microbacterium, Porphyromobacter, Acinetobacter, Lysinibacter, et Sphingosine. Il n'existe qu'une seule espèce de bactérie dans les genres Sphingomonas, Sphingomonas et Curtobacterium.

Grâce à l'identification par PCR DGGE de l'ADNr16, cette étude a révélé que la structure de la communauté bactérienne endophyte de Xiangmaidong était fondamentalement la même au cours de la période d'apparition initiale, de la période d'expansion rapide et de la période de récolte à maturité de ses tubercules, avec peu de différences dans les groupes de souches. L'alignement des séquences a permis d'identifier 15 genres et 21 espèces de bactéries à partir des séquences isolées, dont 3 espèces de Bacillus et 3 espèces de Staphylococcus, 2 espèces de Serratia et 2 espèces de Pseudomonas, et les 11 genres restants, dont Pseudomonas, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Porphyromobacter, Curtobacterium, Enterobacter, Methylobacterium, fixateur d'azote. Il n'y a qu'une seule souche d'Azotobacter, de Microbacterium et de Pseudoclavibacter. Par rapport aux 22 souches de bactéries endophytes pures mentionnées ci-dessus, la DGGE a permis d'identifier 7 nouveaux genres : Serratia, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Methylobacterium, Azotobacter et Pseudomonas.

Cette étude a évalué la capacité de production de saponines de souches endophytiques cultivables pures et a identifié de manière préliminaire trois souches de bactéries, Pseudoxanthomonas mexicana, Staphylococcus caprae et Microbacterium testaceum, présentant des caractéristiques significatives de production de saponines stéroïdiennes. D'après les résultats de la détection CLHP, ces trois bactéries endophytes ont toutes présenté des pics caractéristiques aux points temporels de 15,98, 57,64 et 75,19 minutes, ce qui indique qu'au moins trois saponines dans leurs produits de fermentation peuvent avoir la même structure, ce qui nécessite une vérification expérimentale plus poussée. À l'heure actuelle, il existe deux stratégies principales pour détecter les saponines stéroïdiennes : la première est la détection directe et la seconde est la détection indirecte par l'analyse qualitative et quantitative des saponines clivées. Des chercheurs ont utilisé la méthode HPLC pour déterminer la teneur en dioscine de Dioscorea nipponica, de l'arrowroot, du sisal et des bourgeons de lys. En raison de l'absence d'échantillons purs standard et isolés de saponines stéroïdiennes de Xiangmaidong dans cette expérience, les saponines stéroïdiennes préparées de la racine de Xiangmaidong (mélange) ont été temporairement utilisées comme contrôles positifs. En comparant si des pics caractéristiques au même moment pouvaient apparaître dans les mêmes conditions de détection, les caractéristiques de production de glycosides des bactéries endophytes ont été identifiées de manière préliminaire. À l'avenir, notre laboratoire séparera et purifiera davantage l'extrait de saponine produit par la fermentation et utilisera la spectrométrie de masse, la résonance magnétique nucléaire et d'autres méthodes pour une caractérisation plus précise.

Sur la base de l'analyse DGGE de la région hautement variable de l'ADNr 16 V6 ～ V8, et en combinaison avec les résultats du criblage de bactéries endophytes cultivées pures capables de produire des saponines stéroïdiennes, cette expérience a révélé un phénomène : pendant la période d'expansion rapide et la période de récolte à maturité des tubercules racinaires de Xiangmaidong, on peut détecter la présence de Pseudomonas mexicana P. dans ses tubercules racinaires. Il a été confirmé que la biomasse et la teneur en saponines stéroïdiennes des tubercules de Xiangmaidong augmentent progressivement à partir du stade initial et atteignent leur maximum au cours des phases d'expansion rapide et de maturité de la récolte. Ce phénomène implique-t-il que Pseudomonas aeruginosa au Mexique joue un rôle positivement corrélé dans l'accumulation de saponines stéroïdiennes dans les tubercules d'Ophiopogon japonicus ? Cette question doit également faire l'objet d'une vérification expérimentale plus poussée.