Étude préliminaire de l'effet protecteur de l'icariine activant la voie de signalisation Nrf2 contre les lésions induites par le D-galactose dans les cellules testiculaires Sertoli 15P-1 de souris
Avec le développement continu de l'économie et de la société et la pression croissante sur la survie des personnes, l'infertilité est devenue un problème mondial. La recherche a révélé qu'environ 15% des couples dans le monde souffrent d'infertilité, les facteurs masculins représentant environ 50%, et le mécanisme n'est pas encore entièrement compris. Les cellules de Sertoli testiculaires, seules cellules somatiques connectées aux cellules spermatogéniques, entourent structurellement les cellules souches spermatogoniales, les spermatogonies et les différents niveaux de cellules spermatogéniques, formant une barrière sanguine testiculaire grâce à diverses protéines de jonction serrée telles que l'occludine et la claudine-1. La recherche a montré que les cellules de soutien testiculaires sécrètent divers facteurs de croissance tels que le facteur neurotrophique dérivé de la lignée des cellules gliales (GDNF), la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et le facteur des cellules souches (SCF), qui régulent la prolifération et la différenciation des cellules souches spermatogoniales et favorisent la formation des spermatozoïdes. Une autre étude a montré que les rats mâles exposés au chrome hexavalent pendant la grossesse présentaient une régulation à la baisse de l'expression des protéines de jonction serrée Occludin et Claudin-1 dans les cellules de soutien après l'âge adulte, entraînant une apoptose accrue des cellules spermatogéniques et une altération de la production de spermatozoïdes. Sous l'effet d'un stress thermique, les cellules de Sertoli du testicule bovin sont endommagées et les niveaux d'ARNm du GDNF et du SCF sont régulés à la baisse, ce qui entraîne un dysfonctionnement des spermatozoïdes. Par conséquent, l'amélioration de la structure et de la fonction des cellules de soutien pourrait constituer une nouvelle voie pour le traitement de l'infertilité masculine.

L'épimède est une plante médicinale traditionnelle chinoise aux propriétés nourrissantes, mentionnée pour la première fois dans le "Shennong Bencao Jing". Elle a pour effet de tonifier le yang des reins, de renforcer les muscles et les os et de dissiper le vent et l'humidité. La recherche pharmacologique moderne a montré que l'Epimedium a des effets significatifs pour retarder le vieillissement et améliorer la fonction reproductive masculine. Son principal ingrédient actif est l'icariine (ICA). Des études ont montré que l'ICA peut favoriser la prolifération des cellules de Sertoli primaires chez les rats et améliorer la fonction des cellules de Sertoli mâles. La recherche a montré que l'ICA peut améliorer la fonction reproductrice des rats en augmentant les niveaux d'expression de l'ARNm des récepteurs de l'hormone folliculo-stimulante et de la protéine de jonction serrée Claudin-11 dans les cellules de soutien, améliorant ainsi la résistance au stress antioxydant du tissu testiculaire. Le facteur nucléaire érythroïde de type 2 (Nrf2), principal régulateur du système de défense cellulaire de l'organisme, régule l'expression d'une série de gènes codant pour des protéines antioxydantes et des protéines de réponse au stress oxydatif en se liant à des séquences amplificatrices dans la région régulatrice du promoteur des éléments de réponse antioxydante (ARE), en coordonnant des réponses précises à diverses conditions de stress et attaques nuisibles, et en réalisant l'homéostasie du microenvironnement cellulaire. Des recherches ont montré que l'Epimedium peut atténuer les lésions hépatiques induites par le stress oxydatif en activant Nrf2. Nos recherches antérieures ont montré que l'ICA peut atténuer les lésions de l'ADN dans les cellules germinales testiculaires de rats vieillissant naturellement en régulant à la hausse le Nrf2. L'ICA peut réguler l'expression des protéines Occludin et Claudin-1 liées à la jonction serrée dans la lignée cellulaire de soutien testiculaire de souris TM4 induite par le D-Gal. Cependant, il n'existe actuellement aucun rapport de recherche indiquant si l'ICA peut améliorer les dommages cellulaires 15P-1 induits par le D-Gal par le biais de la voie de signalisation Nrf2. Des études antérieures ont montré que le D-Gal peut induire des lésions de la jonction serrée dans les cellules TM4 de la lignée cellulaire de soutien testiculaire de souris. Par conséquent, cette expérience a utilisé les cellules 15P-1 induites par le D-galactose (D-Gal) comme modèle de dommage pour explorer l'effet protecteur et le mécanisme de l'ICA sur les dommages causés aux cellules de Sertoli par la voie de signalisation Nrf2.

Ces dernières années, l'OMS a reconnu l'infertilité comme un problème de santé publique. Le taux d'incidence de l'infertilité dans la population générale a augmenté d'année en année, touchant environ 15% des couples en âge de procréer dans le monde. Les recherches montrent qu'aux États-Unis et dans d'autres pays occidentaux, le nombre de spermatozoïdes diminue de 1,5% par an, et l'on estime que près de 70 millions de couples dans le monde sont victimes de l'infertilité ou de la stérilité. Une enquête épidémiologique à grande échelle menée par l'OMS a révélé qu'environ la moitié de l'infertilité des couples est causée par des facteurs masculins, et que le mécanisme n'est pas encore entièrement compris.

Des recherches ont montré que la D-Gal peut réduire le nombre et la fonction des cellules TM4 de la lignée cellulaire de soutien de la souris. Par conséquent, nous avons choisi le modèle D-Gal pour évaluer si l'ICA peut atténuer les dommages causés aux cellules 15P-1. La littérature rapporte qu'après un traitement avec 35, 70 et 140 μ M d'ICA sur des cellules endothéliales ECV-304, le taux d'inhibition cellulaire était de 1,2% et qu'il n'y avait pas de cytotoxicité significative. Les résultats MTT de cette expérience ont montré que, par rapport au groupe témoin, lorsque l'ICA était utilisé seul pour traiter les cellules 15P-1, la CI50 était supérieure à 50% à une concentration de 40 μ M, ce qui indique que l'ICA n'avait pas de cytotoxicité significative. Nos recherches préliminaires ont montré que l'ICA a un effet protecteur sur les lésions des cellules TM4 traitées par D-Gal, et a un effet prolifératif significatif à des concentrations de 0,5 et 1 μ M. Les résultats MTT de cette expérience ont également montré que, par rapport au groupe traité par D-Gal, l'ICA a augmenté le taux de survie des cellules de manière dépendante de la concentration à 0,125-1 μ M, et a eu un effet promoteur significatif sur la prolifération des cellules à des concentrations de 0.5 et 1 μ M. L'effet promoteur de l'ICA s'est affaibli lorsque la concentration était supérieure à 1 μ M, ce qui peut être dû au temps de stimulation plus long de la D-Gal sur les cellules 15P-1 dans cette expérience, aux dommages cellulaires plus graves et à la sensibilité considérablement accrue des cellules endommagées à la stimulation du médicament, montrant ainsi un phénomène de promotion à faible concentration et d'inhibition à forte concentration. Les cellules de Sertoli testiculaires sont des cellules somatiques situées dans les tubules séminifères des testicules qui sont directement connectées aux cellules spermatogènes. Elles régulent la prolifération et la différenciation des cellules souches spermatogoniales et favorisent la formation des spermatozoïdes en sécrétant diverses cytokines telles que le GDNF, le BMP4 et le SCF. Le GDNF est un membre de la superfamille du facteur de croissance transformant bêta et un facteur important dans la régulation de la prolifération des cellules souches spermatogoniales. Il joue un rôle crucial dans le développement des cellules reproductrices mâles et dans le développement testiculaire précoce. BMP4 et SCF sont des facteurs importants qui favorisent la différenciation des cellules souches spermatogoniales. Des recherches antérieures menées par notre groupe de recherche ont montré que les flavonoïdes totaux de l'Epimedium peuvent augmenter les niveaux d'ARNm et de protéines du GDNF, du BMP4 et du SCF sécrétés par les cellules de Sertoli dans les testicules de rats vieillissant naturellement, améliorant ainsi la fonction de sécrétion des cellules de Sertoli. Les résultats ont montré que, par rapport au groupe témoin, les niveaux d'expression de l'ARNm et des protéines des facteurs sécrétés par les cellules de Sertoli étaient significativement diminués après le traitement au D-Gal, tandis que les niveaux d'expression de l'ARNm et des protéines des facteurs sécrétés par les cellules de Sertoli étaient significativement augmentés dans le 15P-1 après le traitement à l'ICA. L'ICA peut améliorer la fonction de sécrétion des cellules de Sertoli testiculaires 15P-1.

Les jonctions serrées entre les cellules de soutien sont le composant le plus important de la barrière hémato-testiculaire, comprenant principalement les trois familles de protéines transmembranaires Occludin, Claudin, et les protéines d'adhésion, ainsi que la famille de protéines cytoplasmiques de la jonction de blocage. Les jonctions serrées entre les cellules protègent non seulement les cellules reproductrices de l'invasion du système immunitaire et fournissent un environnement physiologique favorable à la spermatogenèse, mais elles permettent également aux spermatocytes préfin et postfin de traverser régulièrement la barrière sanguine du testicule pour poursuivre leur développement. La recherche a montré que l'occludine et la claudine sont les premières protéines membranaires de jonction serrée identifiées, et que la capacité de jonction serrée et la fonction de barrière épithéliale sont principalement médiées par la claudine. Une autre étude a montré que l'injection de peptide synthétique d'Occludine dans les testicules de rats peut supprimer de manière réversible la plupart des spermatogonies après 27 jours, tandis que l'élimination de l'Occludine in vitro peut également entraîner une diminution de la fonction de jonction serrée des cellules de soutien. Les résultats de cette expérience ont montré que, par rapport au groupe témoin, l'expression de la protéine de jonction serrée dans les cellules 15P-1 a diminué après le traitement au D-Gal, tandis que l'expression de la protéine de jonction serrée dans les cellules de soutien 15P-1 a été significativement augmentée après le traitement à l'ICA. L'ICA a un effet protecteur sur les dommages causés aux protéines de la jonction serrée dans les cellules de soutien 15P-1.

Lorsque l'organisme est dans un état normal, Kelch like ECH associated protein-1 (Keap1) recrute Nrf2 et forme un complexe dans le cytoplasme qui est dégradé par la protéase ubiquitine ; en cas de stress oxydatif, Nrf2 se dissocie de Keap1, et Nrf2 est transféré du cytoplasme au noyau pour se lier à ARE, activant la transcription de gènes protecteurs en aval tels que HO-1 et NQO1, résistant ainsi aux dommages causés par le stress oxydatif causé par divers stimuli de l'organisme. Nos recherches antérieures ont montré que l'ICA peut atténuer les lésions de l'ADN testiculaire chez les rats vieillissant naturellement et améliorer le déclin de la fonction reproductrice causé par le vieillissement en activant la voie de signalisation Nrf2/HO-1. Cela suggère que l'amélioration du dysfonctionnement spermatogénique par l'ICA peut être liée à la voie de signalisation Nrf2. Des études antérieures ont montré que l'ICA peut améliorer les dommages causés par la D-Gal à la lignée cellulaire TM4 du support testiculaire. Par conséquent, cette étude a utilisé le Western blot pour détecter les protéines de la voie Nrf2. Les résultats ont montré que, par rapport au groupe témoin, les niveaux d'expression des protéines importantes de la voie Nrf2 Nrf2, HO-1 et NQO-1 dans les cellules 15P-1 étaient significativement réduits après la stimulation D-Gal, tandis qu'ils étaient significativement augmentés après l'administration de l'ICA. Par la suite, nous avons détecté l'expression et la localisation de Nrf2 à l'aide de la technologie d'immunofluorescence. Par rapport au groupe de contrôle normal, l'expression fluorescente de Nrf2 dans le noyau des cellules 15P-1 dans le groupe traité à la D-Gal était affaiblie, mais s'est améliorée après le traitement à l'ICA. Les résultats ci-dessus suggèrent que les dommages fonctionnels et structurels des cellules 15P-1 sont liés à la régulation négative de la voie de signalisation Nrf2, ce qui entraîne une diminution de la capacité antioxydante cellulaire. L'ICA peut améliorer les dommages des cellules 15P-1 en renforçant leur capacité antioxydante.

En résumé, l'ICA peut augmenter les niveaux d'expression des protéines liées à la sécrétion GDNF, BMP4, SCF, ainsi que les protéines liées à la jonction serrée Occludin et Claudin-1 dans les cellules 15P-1 en activant la voie de signalisation Nrf2, améliorant ainsi les dommages induits par la D-Gal dans les cellules 15P-1. Cette expérience a jeté les bases théoriques de nos recherches ultérieures sur l'effet protecteur et le mécanisme de l'ICA sur les cellules germinales, afin de mieux explorer la valeur d'application de la plante médicinale chinoise Epimedium dans le système reproducteur, et de fournir de nouvelles orientations pour le traitement clinique de l'infertilité masculine.