Recherche sur la méthode de détection à haut débit de l'ergothionéine de Lingzhi
L'ergothionéine (EGT), également connue sous le nom de sel interne de 2-thio-Lhistidine triméthyle, est un acide aminé naturel abondant chez de nombreux animaux et plantes. Il n'est synthétisé que par certains micro-organismes (actinomycètes, streptomycètes), des champignons et certaines cyanobactéries, et ne peut être synthétisé par les organismes animaux eux-mêmes. Le corps humain ne peut ingérer l'EGT qu'à partir de la nourriture et accumuler de fortes concentrations d'EGT dans diverses cellules et tissus par l'intermédiaire du transporteur de cations organiques de type 1 (OCTN1), très spécifique. L'EGT est considéré comme un antioxydant puissant, et Servillo et al. ont étudié son mécanisme antioxydant, estimant qu'il possède un mécanisme d'oxydoréduction unique, et ont proposé un effet antioxydant unique de l'EGT dans les cellules. Le potentiel d'oxydo-réduction standard de l'EGT est de -0,06V, alors que le potentiel des autres thiols est généralement compris entre -0,32V et -0,2V. Par conséquent, l'EGT est plus stable que d'autres antioxydants dans des environnements à pH physiologique et est moins sujet à l'oxydation spontanée. La recherche a montré que l'EGT a de multiples fonctions physiologiques importantes, telles que les effets anti-inflammatoires, la fonction de protection cellulaire obtenue en protégeant l'ADN, la fonction antidépressive obtenue en favorisant la différenciation neuronale et la neurogenèse, la fonction de protection oculaire obtenue en résistant au stress oxydatif ; La fonction de protection cardiovasculaire et cérébrovasculaire obtenue en interrompant l'expression des molécules d'adhésion liées à l'athérosclérose. L'EGT a un large éventail de perspectives d'application dans des industries telles que la médecine, l'alimentation et les cosmétiques en raison de ses effets préventifs et thérapeutiques sur les maladies neurodégénératives obtenus par l'inhibition de la toxicité, et de sa sécurité inhérente.

Les méthodes de production de l'EGT comprennent la synthèse chimique, l'extraction de champignons comestibles et la fermentation microbienne. En raison du coût élevé et de la complexité des deux premières méthodes, la fermentation en profondeur des hyphes de champignons comestibles est actuellement le mode principal de production industrielle de l'EGT. Cependant, les souches naturelles produisent peu d'EGT et il est nécessaire de cultiver des souches industrielles d'EGT à haut rendement par le biais de techniques de sélection. Les méthodes de culture des souches industrielles de champignons comestibles comprennent la sélection par mutagenèse, la sélection par hybridation, la sélection par génie génétique et la sélection par fusion de protoplastes. Cependant, chaque méthode de sélection nécessite de nombreux tests à grande échelle sur la teneur en EGT. Il convient de noter que l'importance des tests de teneur en EGT dans le processus de sélection réside davantage dans la comparaison de la teneur entre les échantillons. À l'heure actuelle, les méthodes de détection de l'EGT comprennent la chromatographie liquide à haute performance, l'électrophorèse capillaire à haute performance et l'électrophorèse en couche mince. La méthode la plus répandue est la chromatographie liquide à haute performance, qui permet de détecter avec précision la teneur en EGT de systèmes matériels complexes. Cependant, la chromatographie liquide à haute performance présente des inconvénients évidents, à savoir qu'elle nécessite d'explorer différentes conditions de détection pour différents échantillons. En outre, en raison du pic tardif de l'EGT et du coût élevé des échantillons standard, la sélection d'échantillons à haut rendement à partir d'un grand nombre d'échantillons en élevage peut entraîner un temps de détection long et un coût élevé, ce qui entrave considérablement le développement et la recherche d'applications de l'EGT. Il est donc urgent d'établir une méthode de détection rapide à haut débit permettant de déterminer avec précision la concentration d'EGT entre les échantillons.
En raison de ses fortes propriétés antioxydantes et de sa réductibilité modérée aux ions ferreux divalents (ni affectée par le contact avec l'oxygène de l'air, ni réduite en raison d'une faible réductibilité), l'EGT peut réagir avec les ions ferreux divalents pour former des chélates incolores, tandis que les ions thiocyanates réagissent avec les ions ferreux divalents pour former des complexes rouges. Sur la base de ces caractéristiques, le thiocyanate de fer a été choisi comme agent réducteur dans cette étude, et l'ergotamine standard a été utilisée pour réagir avec le thiocyanate de fer afin d'établir un système de détection à haut débit pour l'ergotamine. Parallèlement, le système de détection à haut débit a été validé en faisant varier les rendements en EGT de différentes souches de Ganoderma lucidum. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles méthodes et idées pour le criblage de micro-organismes EGT à haut rendement et la sélection de nouvelles souches EGT à haut rendement.

Sur la base des propriétés physicochimiques fortement réductrices de l'ergothionéine, avant de construire le système EGT thiocyanate fer, des expériences ont été menées pour construire le système permanganate de potassium alcalin, le système vert de bromocrésol, le système bleu de méthylène, le système guaiacol et le système EGT de chlorure ferrique. Les résultats ont montré que le système de permanganate de potassium alcalin a échoué en raison de sa faible stabilité ; le développement de la couleur du système de vert de bromocrésol a échoué en raison de la dépendance du pH ; dans le système de bleu de méthylène en bouteille, en raison de la forte réductibilité de l'état réduit du bleu de méthylène, il est également facilement oxydé en bleu de méthylène lorsqu'il est en contact avec l'oxygène de l'air, ce qui entraîne l'échec de l'expérience sans aucun phénomène ; le système de gaïacol a également échoué en raison de la forte réductibilité et de l'interférence du contact avec l'oxygène ; le système de chlorure ferrique a échoué en raison d'un faible rendu des couleurs. Le système de thiocyanate de fer de l'EGT peut être utilisé pour l'étude des méthodes de détection à haut débit de l'EGT.

Lors de la construction du système EGT de détection du fer thiocyanate, il a été constaté que les substances phénoliques résiduelles dans la solution d'extraction affectaient la réaction colorée du système et réduisaient sa sensibilité lorsque l'échantillon testé était extrait à l'aide de la méthode d'extraction brute EGT ordinaire, à savoir l'extraction à volume constant par précipitation à l'alcool et soufflage à l'azote. Par conséquent, après l'extraction à volume constant par soufflage d'azote, une étape d'élimination du phénol au chloroforme doit être ajoutée à la solution d'extraction brute.
Ganoderma lucidum est un champignon médicinal traditionnel et précieux en Chine, qui contient diverses substances bioactives et fonctions physiologiques. Sa teneur en ergothionéine est relativement élevée parmi de nombreux champignons comestibles, mais sa production commerciale reste faible. Par conséquent, la culture d'une nouvelle souche de Ganoderma lucidum produisant beaucoup d'ergothionéine revêt une grande importance et une grande valeur d'application pratique. Sur la base des raisons susmentionnées, notre laboratoire a obtenu un lot de produits de pseudo-fusion par régénération, isolation et identification de la fusion de protoplastes. Les produits de fusion de Ganoderma lucidum utilisés dans le processus de validation de cette méthode sont tous dérivés de cette source.
La méthode établie dans cette étude est basée sur les propriétés physiques et chimiques de l'EGT lui-même, et le système de détection est sensible et stable. Elle convient à la comparaison rapide de grandes quantités d'échantillons dans le processus de sélection des souches de fermentation industrielle productrices d'EGT. En théorie, seule une simple optimisation de l'extraction de l'EGT de l'échantillon est nécessaire pour réaliser une détection rapide à haut débit de la teneur en EGT dans la grande majorité des souches, ce qui permet de dépasser les limites de la recherche originale sur l'EGT et de fournir de nouvelles méthodes et idées pour le développement global et la recherche sur l'application de l'EGT.