Détermination simultanée de six flavonoïdes dans les feuilles de Wuyao par chromatographie liquide à ultra-haute performance et spectrométrie de masse en tandem
Lindera aggregata (Sims) Kosterm, une plante appartenant à la famille du camphre et au genre Piper, a des effets anti-inflammatoires, analgésiques, antioxydants et antitumoraux. Elle est principalement produite dans les provinces côtières du sud-est de la Chine, le comté de Tiantai dans la province de Zhejiang étant le plus célèbre, d'où son nom de Tiantai Wuyao. En 2018, il a été sélectionné comme l'un des nouveaux "Huit saveurs du Zhejiang" dans la province du Zhejiang. La recherche pharmacologique moderne a montré que la médecine noire a également des effets immunomodulateurs sur le système nerveux central et le système cardiovasculaire, ce qui élargit ses perspectives de marché. Toutefois, les parties médicinales du Wuyao poussent lentement et il faut souvent 8 à 10 ans pour répondre aux exigences d'une transformation de qualité des herbes médicinales. Au cours du cycle de croissance, la tige et les feuilles sont souvent jetées, ce qui entraîne une faible utilisation des ressources. Dans les régions populaires du Zhejiang, les feuilles de Wuyao sont souvent utilisées pour traiter la cellulite aiguë, l'arthrite rhumatoïde et d'autres inflammations, et sont également souvent transformées en boissons à base de thé pour abaisser le taux de lipides, protéger le foie et apporter d'autres bienfaits à la santé. Des études antérieures ont montré que les extraits de feuilles de Wuyao ont un certain effet hypolipidémiant. L'équipe de recherche a mené une étude de corrélation pharmacologique sur les extraits de feuilles de Wuyao et a découvert qu'ils ont un certain mécanisme d'action contre l'hyperlipidémie et l'ostéoporose. Parallèlement, les feuilles de Wuyao ont fait l'objet d'une séparation et d'une extraction systématiques des composants chimiques à un stade précoce. Six flavonoïdes ont été isolés pour la première fois à partir de l'extrait éthanolique des feuilles de Wuyao : kaempférol-3-O - α - L-rhamnoside (1), quercétine (2), kaempférol-3-O - β - D-xyloside (3), kaempférol-3-O - α - L-arabinofuranoside (4), kaempférol-3-O - (2 ″ -3-O-trans-3-O-p-3-O-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (5), kaempférol-3-O - (2 ″, 4 ″ -3-O-di-3-O-3-3-O-di-3-glucoside) O-trans-3-O-p-3-O-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (6), structure chimique présentée à la figure 1.

Il existe actuellement des rapports de recherche pertinents sur l'évaluation de la qualité des feuilles de Wuyao. Yi et al. ont utilisé la CLHP pour déterminer la teneur de quatre flavonoïdes dans les feuilles de Wuyao de différentes origines dans la province de Hunan. Sun et al. ont utilisé la spectrophotométrie UV pour déterminer la teneur totale en flavonoïdes des extraits de feuilles de Wuyao et ont étudié les facteurs pertinents pour l'extraction des flavonoïdes totaux, afin d'optimiser le processus d'extraction. Parallèlement, Sun et al. ont utilisé la CLHP pour déterminer la teneur de quatre lactones sesquiterpénoïdes dans des feuilles de Wuyao de différentes origines. Toutefois, il s'agit de méthodes de détection traditionnelles qui manquent d'efficacité et de précision dans la détermination de la teneur. Avec les progrès de la technologie de la spectrométrie de masse, une technologie de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide à ultra-haute performance, très efficace, très spécifique et très sensible, a été mise au point. La chromatographie en tandem par spectrométrie de masse (UPLC-MS/MS) est devenue une méthode analytique importante pour la détection de la qualité des substances médicinales chinoises traditionnelles. Par conséquent, cette étude utilisera la technologie UPLC-MS/MS pour étudier quantitativement les six principaux flavonoïdes dans les feuilles de Wuyao de différentes origines, et combinera le poids entropique - α - L-approximate ideal solution ranking method (TOPSIS) pour l'analyse et l'évaluation, afin de fournir une base scientifique pour le contrôle interne de la qualité des feuilles de Wuyao.

 

Sélection des conditions d'extraction. Dans cette étude, la méthode UPLC-MS/MS a été utilisée pour déterminer simultanément les teneurs de six composés indicateurs, à savoir le kaempférol-3-O - α - L-rhamnoside (1), la quercétine (2), le kaempférol-3-O - β - D-xyloside (3), kaempférol-3-O - α - L-arabinofuranoside (4), kaempférol-3-O - (2"- trans - p-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (5), et kaempférol-3-O - (2", 4"- di trans - p-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (6), dans les feuilles de Wuyao en l'espace de 10 minutes. Les concentrations de méthanol étaient respectivement de 30%, 50% et 70%. Sur la base de l'analyse du spectre, le méthanol 70% a été sélectionné pour obtenir le meilleur effet d'extraction. Parallèlement, une comparaison a été effectuée entre les méthodes d'extraction par chauffage à reflux et par ultrasons. D'après les résultats du contenu, les taux d'extraction obtenus étaient comparables. Compte tenu du temps et des coûts des consommables, l'extraction par ultrasons a été adoptée.
Conditions de chromatographie et de spectrométrie de masse. Cette étude a examiné trois systèmes de phase mobile : acétonitrile eau, acétonitrile-0,1% eau acide formique, et acétonitrile-0,1% eau formiate d'ammonium. La surface et la forme des pics de six flavonoïdes ont été utilisées comme indicateurs d'évaluation pour déterminer le système de phase mobile approprié. Il a été constaté que lorsque l'eau acétonitrile était sélectionnée comme phase mobile, il y avait un phénomène de queue dans les composés de kaempférol-3-O - (2"- trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnoside et kaempférol-3-O - (2", 4"- di-trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnoside ; Lorsque l'eau acétonitrile 0.1% eau de formiate d'ammonium est choisie comme phase mobile, la quercétine 3-O - α - L-arabinofuranoside présente une légère traînée ; Lorsque l'acétonitrile 0,1% eau d'acide formique est choisie comme phase mobile, les formes des pics des six composés sont relativement symétriques. Par conséquent, l'acétonitrile 0,1% d'acide formique a été choisi comme système de phase mobile. Lors de la sélection des conditions de spectrométrie de masse, l'étude a utilisé les modes d'ions positifs et négatifs pour déterminer la teneur de six composés cibles. Afin de garantir que les composés cibles présentent une meilleure stabilité, des valeurs de réponse plus élevées et de meilleures formes de pics, de multiples expériences répétées ont montré que l'utilisation du mode de balayage ionique négatif pour la détection peut rendre les six composés flavonoïdes plus stables, avec de meilleures formes de pics et de meilleures valeurs de réponse dans les conditions de détection. Parallèlement, lors de l'étude des conditions de chromatographie et de spectrométrie de masse, les temps de rétention des flavonoïdes 2 et 5 extraits du chromatogramme ionique de la figure 2 étaient fondamentalement les mêmes. Par rapport aux techniques d'analyse CLHP traditionnelles, la chromatographie-spectrométrie de masse basée sur l'analyse du rapport masse/charge ne repose pas sur la séparation pic à pic, et présente un temps de collecte du signal court et une sensibilité élevée. Par conséquent, dans cette étude, la technologie d'analyse UPLC-MS/MS a été utilisée pour déterminer simultanément six flavonoïdes dans les feuilles de Wuyao, ce qui présente plus d'avantages.
Analyse des résultats. Cette étude a recueilli des échantillons médicinaux provenant de 10 zones de production de Wuyao en Chine et a utilisé la technologie UPLC-MS/MS pour déterminer simultanément la teneur de six composants chimiques dans les feuilles de Wuyao. La méthode TOPSIS à poids entropique a été utilisée pour analyser et évaluer de manière exhaustive les six composés des dix zones de production. Le classement global est le suivant : Tiantai, Zhejiang>Jinhua, Zhejiang>Changsha, Hunan>Ningde, Fujian>Kunming, Yunnan>Tonglu, Zhejiang>Guilin, Guangxi>Yingtan, Jiangxi. Les résultats ont montré que la qualité globale des feuilles de Wuyao à Tiantai, Zhejiang, était relativement élevée, ce qui est lié à la croyance traditionnelle selon laquelle Tiantai, Zhejiang, est une véritable zone de production de matières médicinales de Wuyao. Le Dictionary of Traditional Chinese Medicine indique que la production de Wuyao est la plus importante du Zhejiang et que la qualité des produits fabriqués à Tiantai (Zhejiang) est la meilleure, d'où le nom de "Tiantai Wuyao" ou "Tai Wuyao". Parallèlement, les résultats de l'évaluation montrent également qu'il existe des différences significatives dans la teneur des six principaux flavonoïdes dans les feuilles de Wuyao de différentes origines, ainsi que dans les feuilles de Wuyao de différentes villes de la même province. Cela peut être lié aux sources d'introduction du Wuyao dans différentes bases de plantation et différents environnements écologiques.
À l'heure actuelle, le Wuyao Ye a été approuvé en tant que nouvelle ressource alimentaire, de sorte que le développement de ses produits continuera d'être exploré. Cette étude a établi une méthode facile à mettre en œuvre, présentant une bonne précision, une bonne stabilité et une bonne répétabilité, et permettant de déterminer simultanément la teneur de six flavonoïdes dans le Wuyao Ye. Elle peut être utilisée pour l'analyse quantitative et l'évaluation complète des principaux flavonoïdes du Wuyao Ye, et la méthode TOPSIS à poids entropique utilisée fournit également une base théorique pour l'évaluation de la qualité d'autres plantes médicinales ayant une valeur médicinale.