Screening neuer antiviraler Verbindungen aus der Naturstoffbibliothek der traditionellen chinesischen Medizin auf der Grundlage der Struktur der Glykoproteinmonomere des Ebola-Virus
Das Ebola-Virus (EBOV) ist ein umhülltes filamentöses Virus, das akutes hämorrhagisches Fieber verursacht. Es handelt sich um eine zoonotische Infektionskrankheit, die häufig bei Primaten vorkommt und eine Sterblichkeitsrate von bis zu 50% bis 90% aufweist. In den letzten Jahren gab es mehrere schwere Ebola-Ausbrüche in Westafrika, aber bisher sind keine spezifischen Medikamente zur Behandlung des hämorrhagischen Ebola-Fiebers zum Verkauf zugelassen. Der Eintritt von EBOV in Wirtszellen ist ein kritischer Schritt bei der Infektion, der durch das virale Oberflächen-Transmembran-Glykoprotein sgP vermittelt wird. Dieses Typ-I-Fusionsprotein enthält zwei Untereinheiten, die durch Disulfidbindungen verbunden sind, nämlich GP1, das an der Oberfläche exponiert ist, und GP2, das in die Virusmembran eingebettet ist. Nach der Bindung an die Wirtszelle durch Zelloberflächen-Attachment-Faktoren wird das Virus internalisiert, und die entsprechenden Cysteinproteasen und Proteasen im Endosom spalten die meisten Peptidketten der GP1-Untereinheit ab und legen die Rezeptorbindungsstelle frei. Dieser Konformationswechsel von GP erleichtert die Fusion der Wirtsvirusmembran und die anschließende Freisetzung des Virusgenoms. Dieser Fusionsmechanismus ist dem des HIV-1-Virus und des Influenzavirus ähnlich. Daher kann die Entwicklung von Hemmstoffmolekülen, die den Konformationsübergang von EBOV sgP wirksam stören, dazu beitragen, die Virusinvasion und -vermehrung zu blockieren.

Im Jahr 2019 haben Elizabeth E. Fry und ihr Team von der Abteilung für Strukturbiologie an der Universität Oxford im Vereinigten Königreich das EBOV sgP-Protein mithilfe der Proteinexpressions-Reinigungs-Kristallisationstechnologie erfolgreich hergestellt und seine dreidimensionale Struktur mithilfe von Röntgenbeugungsexperimenten bestimmt (RCSB Protein Data Bank ID: 5JQ7), wodurch ein virtuelles Screening-Modell am Computer erstellt wurde. Aufgrund der einzigartigen Struktur und Vielfalt der natürlichen Produkte, insbesondere der Inhaltsstoffbibliotheken der traditionellen chinesischen Medizin, wurden sie zur Behandlung verschiedener chronischer und infektiöser Krankheiten eingesetzt und können auch zur Erforschung von Hemmstoffen gegen das Ebola-Virus verwendet werden. Basierend auf den oben genannten Überlegungen wird in dieser Studie die Computersimulationstechnologie eingesetzt, um EBOV sgP-Inhibitormoleküle aus der Naturstoffbibliothek der traditionellen chinesischen Medizin zu untersuchen.

Ahmads Forschungsgruppe hat 2017 erstmals die dreidimensionale Struktur von EBOV-GP-Transmembran-Glykoprotein-Trimer-Hohlräumen auf der Grundlage der Mcule-Verbindungsbibliothek untersucht（ https://mcule.com/database /Das virtuelle Screening von Inhibitoren im großen Maßstab mit zwei molekularen Docking-Programmen, Auto Dock Vina und Flex-X, in Kombination mit dem Online-Analyse-Tool admetSAR（ http://www.admetexp.org ）ADMET-Filterung wurde durchgeführt und drei Hit-Moleküle wurden gefunden. Seit dem Jahr 2000 gibt es immer wieder Ausbrüche des Ebola-Virus, und die Erforschung und Entwicklung antiviraler Moleküle ist nach wie vor ein globaler Hotspot der Pharmaforschung. Um antiviral wirksame Moleküle aus der Naturstoffbibliothek der traditionellen chinesischen Medizin zu gewinnen, wurde in dieser Studie auf die Forschungsideen dieses Artikels zurückgegriffen, das Ziel von EBOV-GP-Trimer auf Monomer geändert und die experimentelle Methode des virtuellen Mehrrunden-Screenings umgestaltet. Die Screening-Strategie verwendet teurere Algorithmen, um die Genauigkeit der Vorhersage so weit wie möglich zu verbessern, die Falsch-Positiv-Rate des virtuellen Screenings zu verringern und die Bindungskonformation besser vorherzusagen. Darüber hinaus sind die Molekulardynamiksimulation und die Berechnung der freien Bindungsenergie ebenfalls wichtige Instrumente zur Untersuchung der Stärke von Protein-Inhibitor-Interaktionen. Die GROMACS-Software wird für die Molekulardynamiksimulation verwendet, und der MM/PBSA-Algorithmus wird zur Vorhersage der freien Bindungsenergie des Systems nach der Stabilisierung eingesetzt. Diese Methoden liefern nicht nur Details über die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Inhibitoren auf atomarer und molekularer Ebene, sondern erleichtern auch die Aufklärung der strukturellen Affinitätsbeziehung zwischen Protein-Inhibitor-Komplexen.

Um den Konformationsübergang von EBOV sgP wirksam zu stören, zielt diese Studie auf die aktive Kavität des EBOV GP-Monomers ab und sucht nach Hemmstoffmolekülen aus der Naturstoffbibliothek der traditionellen chinesischen Medizin, um die Membranfusion des Wirtsvirus zu blockieren. Zunächst werden die fünf Lipinski-Prinzipien und die drei Verber-Prinzipien befolgt, um Verbindungen herauszufiltern, die das Prinzip der Drogenähnlichkeit verletzen. Dann wurde die Glide-Software verwendet, um molekulare Docking-Berechnungen mit drei verschiedenen Genauigkeiten durchzuführen, nämlich HTVS (Hochdurchsatz), SP (Standardpräzision) und XP (Ultrapräzision), wodurch die Größe der Bibliothek der Kandidatenverbindungen schrittweise reduziert wurde. Zwei Schlüsselindikatoren für die Analyse der Pharmakokinetik und der Arzneimittelsicherheit, darunter die Hepatotoxizität HERG_IC50 und die orale Bioverfügbarkeit, wurden hinzugefügt. In Kombination mit den von Lipinski Ro5 und Verber Ro3 vorhergesagten Werten wurde eine relativ umfassende Bewertung des Wirkstoffs vorgenommen. Bei der Analyse des Bindungsmodus zwischen den Zielproteinen und den Hit-Molekülen wurde eine leistungsstarke GPU-Beschleunigungstechnologie verwendet, um den Bewegungszustand der Biomoleküle unter realen physiologischen Salzlösungsbedingungen zu simulieren. Molekulardynamiksimulationen wurden für 50 ns durchgeführt, und MM/GBSA- und MM/PBSA-Algorithmen wurden verwendet, um die freie Bindungsenergie vorherzusagen und die Anreicherungsgenauigkeit zu verbessern. Basierend auf dem XP-Glide-Score, der RMSD, dem RMSF, der MM/GBSA-Bindungsenergie, der MM/PBSA-Bindungsenergie und der ADME-Vorhersage zeigten die Hit-Moleküle MOL006834, MOL000174, MOL002192 und MOL012524 schließlich eine ausgezeichnete Bindungsaffinität und gute arzneimittelähnliche Eigenschaften gegenüber dem aktiven Zentrum von EBOV sgP; Vorhersage der tatsächlichen Bindungskonformationen der Treffermoleküle MOL006834, MOL000174, MOL002192, MOL012524 mit Transmembranglykoproteinen auf atomarer und molekularer Ebene, einschließlich Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen, Ionenbindungen, π-π-Stapelkräfte usw., Sie zeigen hervorragende Wechselwirkungen mit wichtigen Aminosäureresten. Diese vier Hit-Moleküle können kommerziell erworben und als Leitverbindungen für EBOV sgP-Inhibitoren entwickelt sowie durch Experimente zur Arzneimittelaktivität validiert werden. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass das Ebola-Virus eine hohe Sterblichkeitsrate und eine hohe Übertragbarkeit aufweist und die entsprechenden Anforderungen an die biologische Sicherheit äußerst streng sind. Experimente zur Prüfung der antiviralen Aktivität müssen in Labors der Biosicherheitsstufe 4 durchgeführt werden, und in China gibt es nicht viele Labors mit dieser Stufe, was die Grundlagenforschung zum Ebola-Virus einschränkt. Daher beschränken sich die Ergebnisse dieser Studie auf die frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung und es fehlen experimentelle Daten zur Validierung der antiviralen Aktivität und zur ADMET-Bewertung. In der späteren Phase ist es notwendig, mit relevanten virologischen Forschungsteams zusammenzuarbeiten und professionelle virologische Forschungsplattformen zu nutzen, um eine sichere und effektive biologische Validierung durchzuführen.