Optimierung des Paraherquamid A-Fermentationsprozesses mittels Response Surface Methodology
Die parasitäre Nematodenkrankheit ist eine parasitäre Erkrankung von Vieh und Geflügel, die die Entwicklung der Tierhaltung stark beeinträchtigt. Gegenwärtig sind Avernectine die in der klinischen Veterinärpraxis weltweit am häufigsten verwendeten antiparasitären Arzneimittel. Aufgrund des Missbrauchs dieses Medikaments sind jedoch in vielen Gebieten arzneimittelresistente Stämme aufgetreten. In den späten 1980er Jahren führte China diese Art von Medikamenten ein und setzte sie in großem Umfang ein, und inzwischen haben die Magen-Darm-Nematoden von Hausschafen einen unterschiedlichen Grad an Resistenz gegen Avermectin-Medikamente entwickelt. Startect ® ist ein neuartiges orales Kurzzeit-Entwurmungsmittel für Schafe, das von Zoetis, dem weltweit größten Unternehmen für Tierarzneimittel und -impfstoffe, entwickelt wurde und mit dem sich parasitäre Vieh- und Geflügelkrankheiten und deren Resistenzprobleme wirksam verhindern und lösen lassen. Die Wirkstoffe dieses Medikaments sind Derquantel (10mg/mL) und Avermectin (1mg/mL). Die Standarddosis von Startect ® beträgt 1mL/5kg (Flüssigkeitsvolumen/Schafskörpergewicht), und für ein erwachsenes Schaf von 50kg werden etwa 0,1g Dexmedetomidin einmalig verabreicht. Nach den Statistiken der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO) beläuft sich der weltweite Schafbestand auf 1,2 Milliarden Tiere. Der potenzielle Bedarf an Dequnt geht daher in die Hunderte von Tonnen oder sogar darüber hinaus, und die Marktnachfrage ist enorm.

Dextrant ist ein chemisches Derivat des Pilzmetaboliten Paraherquamid A (PA), das hauptsächlich durch Amidcarbonylreduktion und Desoxygenierung von PA gewonnen wird (siehe Abbildung 1). Daher wird die industrielle Rohstoffversorgung von Dequnte hauptsächlich durch die PA-Produktion beeinflusst. Die chemische Struktur von Naturprodukten wie Paraherquamid ist jedoch komplex. Sie können zwar aus industriellen Rohstoffen wie Isopren oder Isopren-Epoxiden chemisch synthetisiert werden, aber ihre chemischen Reaktionsschritte können bis zu 46 Schritte umfassen, was zu hohen Kosten und extrem niedrigen Ausbeuten (2,5%) führt und die Herstellung im industriellen Maßstab erschwert. Die Produktion von PA durch mikrobielle Fermentation ist derzeit ein effektiver Weg, um diese Verbindung in großem Maßstab zu gewinnen. PA wurde zunächst aus dem Fermentationsprodukt eines Stammes von Penicillium paraherquei isoliert, einem Pilz der Gattung Penicillium. Allerdings war die Potenz von PA, das vom Wildtyp-Penicillium produziert wurde, nicht hoch, was seine weitere experimentelle Forschung und industrielle Anwendung behinderte. Bei der Anwendungsforschung von Pilzmetaboliten hängt die Potenz des Zielmetaboliten nicht nur von der Leistung des Stammes selbst ab, sondern vor allem von der Optimierung der Fermentations- und Kultivierungsbedingungen, um die Produktionskapazität voll auszuschöpfen. Die Response-Surface-Methode wird derzeit häufig zur Optimierung mikrobieller Fermentationskulturen eingesetzt. Diese Methode kombiniert Versuchsplanung und mathematische Modellierung und hat die Vorteile, dass weniger Experimente durchgeführt werden müssen, die Zyklen kürzer sind, die Genauigkeit der Regressionsgleichungen höher ist, die Vorhersagekraft besser ist und die Wechselwirkung zwischen mehreren Faktoren untersucht werden kann.

Im Rahmen der Vorarbeiten entdeckte unsere Forschungsgruppe einen aus dem Meer stammenden Penicillium-Pilz KWF31 mit hoher PA-Produktion. Die erste Untersuchung zeigte, dass seine Fermentationsleistung 55,8 ± 3,7mg/L unter dem Chatelier-Medium betrug, was nicht den Anforderungen der industriellen Produktion entsprach. Ziel dieser Studie ist es, das Fermentationsmedium des Stammes KWF31 mit Hilfe von Response-Surface-Methoden wie dem Plackett-Burman-Design, dem Steilanstiegsdesign und dem Box-Behnken-Design zu optimieren und ein Prozessschema für eine ertragreiche und stabile PA-Produktion zu entwickeln.

PA ist ein Isopentenyl-Indol-Alkaloid mit einzigartiger chemischer Struktur und hervorragender Insektenschutzwirkung. Es ist ein Rohstoff für die Synthese des kommerziellen Insektenschutzmittels Dextrant und hat einen hohen Marktwert und eine große Marktnachfrage. Der Wildtyp-Penicillium-Stamm liefert jedoch nur eine geringe Ausbeute an PA, da mehrere chemische Syntheseschritte erforderlich sind und die Ausbeute gering ist, was es schwierig macht, die Marktnachfrage zu decken. In dieser Studie wurden mit Hilfe des Plackett-Burman-Designs aus acht Faktoren (lösliche Stärke, Glukose und Hefeextrakt) drei Mediumskomponenten herausgefiltert, die einen signifikanten Einfluss auf die horizontale Fermentationsproduktion von PA durch den Wildstamm KWF31 in Schüttelkolben haben; ihre Konzentrationen wurden schrittweise mit Hilfe von Kletterexperimenten und Box-Behnken-Design optimiert. Die optimierten optimalen Konzentrationen sind lösliche Stärke 31,0 g/L, Glukose 1208 g/L und Hefeextrakt 14,5 g/L. In diesem Medium zeigte der Wildtyp-Stamm KWF31 eine hohe Potenz von 243,7 mg/L für die PA-Produktion während der horizontalen Fermentation im Schüttelkolben, was 3,4-mal höher war als vor der Optimierung (55,8 mg/L). Der in dieser Studie etablierte Prozess für die Fermentationsproduktion von PA durch den marinen Pilz KWF31 weist eine gute Reproduzierbarkeit, Stabilität und Kontrollierbarkeit auf. Auf dieser Grundlage legt die weitere Entwicklung industrialisierter Fermentationsprozesse den Grundstein für die Entwicklung neuer Anti-Nematoden-Pestizide in China, was eine wichtige theoretische und praktische Bedeutung für die Förderung einer gesunden Entwicklung der Tierhaltung in China hat.