Optimering af paraherquamid A-fermenteringsprocessen ved hjælp af responsoverflademetodik
Parasitære nematoder er en parasitisk sygdom hos husdyr og fjerkræ, som i høj grad påvirker udviklingen af dyrehold. På nuværende tidspunkt er avernectiner de mest anvendte antiparasitære lægemidler i veterinær klinisk praksis verden over. Men på grund af misbrug af dette lægemiddel er der opstået lægemiddelresistente stammer i mange områder. I slutningen af 1980'erne introducerede og udbredte Kina denne type lægemiddel, og nu har gastrointestinale nematoder hos tamfår udviklet varierende grader af resistens over for avermectin-lægemidler. Startect® er en ny type oralt korttidsvirkende ormemiddel til får, der er udviklet af Zoetis, verdens største lægemiddel- og vaccinevirksomhed inden for dyresundhed, og som effektivt kan forebygge og løse parasitære sygdomme hos husdyr og fjerkræ og deres resistensproblemer. De aktive ingredienser i dette lægemiddel er derquantel (10mg/mL) og avermectin (1mg/mL). Standarddosis af Startect ® er 1 ml/5 kg (væskevolumen/fårets kropsvægt), og hvert 50 kg voksent får kræver ca. 0,1 g Dexmedetomidine, der skal administreres én gang. Ifølge statistikkerne fra FN's Fødevare- og Landbrugsorganisation (FAO) er verdens fårebestand nået op på 1,2 milliarder. Derfor er den potentielle efterspørgsel efter Dequnt i hundredvis af tons eller endnu højere, og markedsefterspørgslen er enorm.

Dextrant er et kemisk derivat af svampemetabolitten paraherquamid A (PA), som hovedsageligt opnås gennem amidcarbonylreduktion og deoxygenering af PA (se figur 1). Derfor er den industrielle råvareforsyning af Dequnte hovedsageligt påvirket af PA-produktion. Den kemiske struktur af naturlige produkter som paraherquamid er imidlertid kompleks. Selvom de kan syntetiseres kemisk fra industrielle råmaterialer som isopren eller isoprenepoxider, kan deres kemiske reaktionstrin nå op på 46 trin, hvilket resulterer i høje omkostninger og ekstremt lave udbytter (2,5%), hvilket gør det vanskeligt at producere i industriel skala. Produktionen af PA gennem mikrobiel fermentering er i øjeblikket en effektiv måde at opnå denne forbindelse på i stor skala. PA blev først isoleret fra fermenteringsproduktet fra en stamme af Penicillium paraherquei, en svamp, der tilhører slægten Penicillium. Styrken af PA produceret af vildtypen Penicillium var dog ikke høj, hvilket forhindrede yderligere eksperimentel forskning og industriel anvendelse. I anvendelsesforskningen af svampemetabolitter afhænger styrken af målmetabolitten ikke kun af selve stammens ydeevne, men endnu vigtigere af at optimere fermenterings- og dyrkningsbetingelserne for at udnytte dens produktionskapacitet fuldt ud. Responsoverflademetoden bruges i øjeblikket i vid udstrækning til at optimere mikrobiel fermenteringskultur. Denne metode kombinerer eksperimentelt design og matematisk modellering og har fordelene ved færre eksperimenter, kortere cyklusser, højere nøjagtighed ved opnåelse af regressionsligninger, bedre forudsigelighed og undersøgelse af samspillet mellem flere faktorer.

I det indledende arbejde opdagede vores forskningsgruppe en marineafledt Penicillium-svamp KWF31 med høj PA-produktion. Den indledende undersøgelse viste, at dens fermenteringspotentiale var 55,8 ± 3,7 mg/L under Chatelier-mediet, hvilket ikke opfyldte kravene til industriel produktion. Formålet med denne undersøgelse er at optimere fermenteringsmediet for stamme KWF31 ved hjælp af responsoverflademetoder som Plackett Burman-design, steepest climb-design og Box Behnken-design og etablere en teknologisk ordning med højt udbytte og stabil PA-produktionsproces.

PA er et isopentenylindolalkaloid med en unik kemisk struktur og fremragende insektresistensaktivitet. Det er et råmateriale til syntese af det kommercielle insektresistente middel Dextrant og har en høj markedsværdi og stor efterspørgsel på markedet. Den vilde Penicillium-stamme har dog et lavt udbytte af PA, med flere kemiske syntesetrin og lavt udbytte, hvilket gør det vanskeligt at imødekomme markedets efterspørgsel. Denne undersøgelse brugte Plackett Burman-design til at screene tre mediumkomponenter, der signifikant påvirker den horisontale fermenteringsproduktion af PA af vildstammen KWF31 i rystekolber fra otte faktorer: opløselig stivelse, glukose og gærekstrakt; Deres koncentrationer blev gradvist optimeret ved hjælp af klatreeksperimenter og Box Behnken-design. De optimerede optimale koncentrationer er opløselig stivelse 31,0 g/l, glukose 1208 g/l og gærekstrakt 14,5 g/l. I dette medium viste vildtypestammen KWF31 en høj styrke på 243,7 mg/L for PA-produktion under horisontal fermentering i rystekolbe, hvilket var 3,4 gange højere end før optimeringen (55,8 mg/L). Den proces, der blev etableret i denne undersøgelse til fermenteringsproduktion af PA af den marine svamp KWF31, har god reproducerbarhed, stabilitet og kontrollerbarhed. På dette grundlag lægger den videre udvikling af industrialiserede fermenteringsprocesser grundlaget for udviklingen af nye pesticider mod nematoder i Kina, hvilket har vigtig teoretisk og praktisk betydning for at fremme en sund udvikling af dyrehold i Kina.