Studie über die durch Leukamenin E ausgelöste Umstrukturierung des Zytoplasmaskeletts und die Hemmung der Migration in menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen HeLa
Die Mikrofilamente, Mikrotubuli und intermediären Fasern in eukaryontischen Zellen sind mit ihren Bindungsproteinen zu einem hochgradig geordneten dreidimensionalen Netzwerk verbunden, das einem zytoplasmatischen Skelettsystem ähnelt. Sie sind an wichtigen zellulären Lebensprozessen wie dem Materialtransport, der Informationsübertragung, der Zellteilung, der Zellwanderung und der Erhaltung der Zellmorphologie beteiligt. Der dynamische Prozess des Zytoskeletts ist stark reguliert, um die Bedürfnisse der zellulären Lebensaktivitäten zu erfüllen, und eine Störung seines Aufbaus kann zur Hemmung des Zellwachstums, zum Stillstand der Zellteilung und sogar zur Zellapoptose führen. Einige Antitumormedikamente können das dynamische Gleichgewicht der Mikrotubuli stören, indem sie die Depolymerisation und Polymerisation des Zytoskeletts verändern und dadurch die Zellproliferation hemmen und eine Antitumorwirkung entfalten. Die aus Pflanzen gewonnenen Krebsmedikamente Catharanthus-Alkaloide und Taxane können sich mit β-Tubulin verbinden, den dynamischen Prozess des Mikrotubuli-Skeletts stören und zur Behandlung einer Vielzahl von Tumoren eingesetzt werden, darunter Brustkrebs, Lungenkrebs, Neuroblastom, Rhabdomyosarkom, akute Leukämie usw. Die Erforschung und Entdeckung von Antitumormedikamenten, die auf das Zytoskelett und die damit verbundenen Proteine abzielen, ist ein sehr aktives Forschungsgebiet geworden.

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wirken als Signalmoleküle in den Zellen und sind an wichtigen zellulären Lebensprozessen wie der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt. Aufgrund von Veränderungen der Stoffwechselwege in Tumorzellen steigt der Gehalt an ROS, insbesondere an H2O2, wodurch Tumorzellen empfindlicher auf Veränderungen des ROS-Gehalts reagieren. Daher wurden spezifische Veränderungen der intrazellulären Komponenten durch die ROS-Erzeugung und die antioxidative Abwehr als Ziele für die Krebsbehandlung identifiziert. Die Forschung hat gezeigt, dass durch NADPH-Oxidase und andere Quellen erzeugte ROS Mikrofilamente, Mikrotubuli und intermediäre Seidenproteine direkt verändern können, indem sie ihre dynamischen Zusammenbau- und Abbauprozesse beeinflussen, oder das Zytoskelett durch Aktivierung der Rho-GTPase stromaufwärts über entsprechende Signalwege umgestalten. Durch NADPH-Oxidase vermittelter intrazellulärer oxidativer Stress spielt ebenfalls eine wichtige regulatorische Rolle bei Erkrankungen des Zytoskeletts. In den letzten Jahren haben Forscher großes Interesse an der Beteiligung von ROS an der Regulierung der Dynamik des Zytoskeletts gezeigt.

In China gibt es über 90 Pflanzenarten der Gattung Camellia, von denen etwa 30 für medizinische Zwecke verwendet werden. Unter ihnen wurde Isodon rubescens einst in das chinesische Arzneibuch aufgenommen und wird hauptsächlich zur Behandlung von antibakteriellen, entzündungshemmenden und tumorhemmenden Krankheiten eingesetzt. Oridonin, der Hauptwirkstoff von Lonicera japonica, wurde ausgiebig auf seinen Anti-Tumor-Mechanismus hin untersucht, und seine strukturellen Abwandlungen wurden in klinischen Versuchen der Phase I als Mittel gegen Leukämie getestet. Es wurden mehr als 1300 Arten enantiomerer Kaempferolditerpene entdeckt, die vor allem in den Zweigen und Blättern von Pflanzen der Gattung Camellia reichlich vorhanden sind. Diese Verbindungen weisen eine umfangreiche krebsbekämpfende Wirkung auf und dürften zur Entdeckung neuer Antitumormittel führen. Bisher wurden nur wenige enantiomere Diterpene wie Arbutin umfassend und systematisch auf ihre krebsbekämpfenden Mechanismen hin untersucht. Andere Diterpene dieser Art sind noch nicht ausreichend erforscht, doch wurden in den letzten Jahren bedeutende Fortschritte erzielt. In den letzten Jahren wurde festgestellt, dass bestimmte Enantiomere von Kaempferol-Diterpenen auf das Zytoskelettsystem einwirken und eine krebshemmende Wirkung entfalten können. So zielt Bacteriocin A direkt auf das BubR1-Protein ab, um den Kontrollpunkt für den Spindelaufbau zu aktivieren, den Übergang von der mittleren zur späten Zellphase zu verhindern und die mitotische Phase der Leukämiezellen Raji und Jurkat zu hemmen; Wangzaozin A und Epinodosin induzieren die Umstrukturierung des Zytoskeletts (Mikrofilamente, Mikrotubuli und Intermediärfilamente) in HeLa- bzw. HL-60-Zellen, was mit der Induktion der Zelldifferenzierung einhergeht; Leukamenin E kann auch die Keratinphosphorylierung in HUVEC- und PLC-Zellen induzieren und dadurch den normalen Aufbau von Keratinfasernetzen blockieren. In diesem Artikel werden die Auswirkungen von Leukamenin E auf die Umstrukturierung von drei Skelettfasern (Mikrofilamente, Mikrotubuli und Keratinfasern) in HeLa-Zellen sowie die möglichen Mechanismen der Hemmung des Zellwachstums und der Migration beschrieben. Die Studie liefert Anhaltspunkte für die Aufklärung der molekularen Anti-Krebs-Mechanismen der enantiomeren Kaempferol-Diterpenoide sowie wissenschaftliche Grundlagen für die weitere Entwicklung und Anwendung dieser Verbindung.

In den letzten Jahren hat die pharmakologische Anti-Krebs-Aktivität enantiomerer Kaempferol-Diterpene das Interesse der Forscher auf sich gezogen. Es gibt immer mehr Berichte über die krebsbekämpfenden Mechanismen dieser Verbindungen mit unterschiedlichen molekularen Konfigurationen, und es hat sich gezeigt, dass ihre Auswirkungen auf zelluläre Lebensprozesse vielfältig sind und auf molekularer Ebene mehrere Ziele ansprechen. Zum Beispiel induzieren sie Zellapoptose und -differenzierung durch verschiedene zelluläre Signalwege; sie zielen auf die Peroxidasen I und II, das BubR1-Protein und das Krebsprotein AML1-ETO ab, können die NADPH-Oxidase-Aktivität regulieren und die Keratinphosphorylierung induzieren. Unsere Forschungsgruppe hat nacheinander die Auswirkungen der enantiomeren Kaempferol-Diterpene auf das Zytoskelettsystem untersucht: Leukamenin E kann die Phosphorylierung von Zellkeratin K8 und K18 induzieren und den Keratinaufbau hemmen; Epinodosin und Wangzaozin A können den dynamischen Aufbau des Zytoskeletts in HL-60- und HeLa-Zellen beeinflussen, indem sie eine Umstrukturierung des zytoplasmatischen Zytoskeletts verursachen, die Verteilung von Mikrofilamenten, Mikrotubuli und intermediären Skelettfasern verändern und die Homöostase des zytoplasmatischen Zytoskelettsystems stören. Ihre Wirkungsmechanismen sind jedoch nicht gut verstanden.

In diesem Artikel untersuchten wir zunächst die Merkmale der Umstrukturierung des Zytoskeletts von HeLa-Zellen, die durch niedrige Konzentrationen von Leukamenin E (0,4-1,0 μ mol/L) ausgelöst wurde. Niedrige Konzentrationen von Leukamenin E veränderten die Morphologie der Zellen nach längerer Behandlung (48h und 72h) signifikant, was zur Bildung langer Streifen, einer signifikanten Verringerung der Anzahl von Pseudopodien, einer Verlängerung der Pseudopodien und einer signifikanten Veränderung der Kernmorphologie mit einer Zunahme der Anzahl "nierenförmiger Kerne" führte. Bekanntlich haben Mikrofilamente, Mikrotubuli und mittlere Fasern alle die Funktion, die Morphologie der Zellen und ihrer Kerne aufrechtzuerhalten. Daher deuten diese Veränderungen darauf hin, dass Leukomenen E das dynamische Gleichgewicht des Zytoskeletts stören und eine Umstrukturierung des Zytoskeletts bewirken kann. Weitere Fluoreszenzfärbungen bestätigten diese Vermutung: Die Zahl der zytoplasmatischen Stressfasern nahm ab, Mikrotubuli und Keratinfasern sammelten sich um den Zellkern, die Anordnung der Mikrotubuli und Keratin-Zwischenfasern änderte sich erheblich, und einige Mikrotubuli und Keratin-Zwischenfasern verdickten sich. Die durchflusszytometrische Analyse bestätigte auch eine Abnahme der kohäsiven Mikrofilamente, eine deutliche Zunahme der aggregierten Mikrotubuli und eine leichte Zunahme der Keratinfaserpolymerisation in HeLa-Zellen. Dieses Ergebnis ähnelt unserem früheren Bericht über die Induktion einer Umstrukturierung des Zytoskeletts in HeLa-Zellen durch das enantiomere Diterpenoid Wangzaozin A. Die Behandlung von HepG2-, H1299-, PLC- und HUVEC-Zellen mit Leukamenin E in hohen Konzentrationen (2,0 bis 4,0 μ mol/L) für 24 Stunden führte jedoch zu minimalen Veränderungen in der Zellmorphologie, die sich völlig von den Veränderungen unterscheiden, die nach der Behandlung in niedriger Konzentration beobachtet wurden. Wir fanden heraus, dass hohe Konzentrationen von Leukomenen E den ERK-Signalweg in den Zellen aktivieren, die Phosphorylierung von K8-S431/73 und K18-S52 induzieren, den Zusammenbau von Keratinfasern hemmen und die Anzahl der Keratinfasern verringern können. Dies deutet darauf hin, dass unterschiedliche Konzentrationen von Leukomenen E an der Regulierung verschiedener Signalwege in Zellen beteiligt sein können und unterschiedliche zelluläre Reaktionen hervorrufen.

Die tiefgreifende Beteiligung des Zytoskeletts an der Zellteilung und -wanderung steht in engem Zusammenhang mit der Entstehung und dem Verfall von Zellkrebs. Das dynamische Fasernetzwerk, das sich aus dem Zytoskelett und regulatorischen Proteinen zusammensetzt, ist am Prozess der Zellmigration beteiligt, der sich in kontinuierlichen Veränderungen der Zellmorphologie, der Reorganisation des Zytoskeletts und dem Antrieb der gerichteten Zellbewegung äußert. Substanzen, die auf das Zytoskelett abzielen, wie Cytochalasin, Colchicin und Vincristin, hemmen die Zellproliferation und -migration, indem sie den Aufbau des Zytoskeletts beeinflussen. Unsere Forschung zeigt, dass 0,8~1,0 μ mol/L Leukomenen E das dynamische Gleichgewicht des Zytoskeletts der HeLa-Zellen stören kann, was zu einer erheblichen Umstrukturierung des Zytoplasmazytoskeletts führt, die Zellmigration hemmt und die Zellproliferationsrate durch Blockierung des Zellzyklus verringert. Dies deutet darauf hin, dass Leukomenen E für die Erforschung und Entdeckung neuer Krebsmedikamente von großem Wert ist.

ROS ist eine Art von sauerstoffhaltigen freien Radikalen, die in lebenden Organismen gebildet werden und aktiver sind als molekularer Sauerstoff wie O2, H2O2, - OH usw. Unter normalen physiologischen Bedingungen spielt ROS eine wichtige Rolle als zweiter Bote bei der Bestimmung des Zellschicksals und der Veränderung verschiedener Signalmoleküle. Die Forschung hat bestätigt, dass ROS am Signalweg der Umgestaltung des Zytoskeletts beteiligt sind, indem sie das Zytoskelett oder mit dem Zytoskelett verbundene Proteine direkt verändern, und ein wichtiger Regulierungsfaktor für die Struktur und Funktion des Zytoskeletts sind. Zuvor hatten wir berichtet, dass Leukomenen E den intrazellulären ROS-Gehalt erhöhen und HL-60-Zellen zur Differenzierung in reife Granulozyten veranlassen kann, indem es die NADPH-Oxidase-Aktivität in HL-60-Zellen reguliert. In dieser Studie führte die Behandlung von HeLa-Zellen mit 0,4~1,0 μ mol/L Leukomenen E zu einem signifikanten Anstieg der intrazellulären ROS-Konzentration, und der ROS-Gehalt stieg mit zunehmender Wirkstoffkonzentration und längerer Behandlungsdauer signifikant an. Wir spekulieren, dass ROS ein vorgelagertes Ereignis von Leukomenen E-induzierten morphologischen Veränderungen der Zelle, der Hemmung der Zellmigration und der Umstrukturierung des Zytoskeletts sein könnte. Leukomenen E könnte die Umstrukturierung des Zytoskeletts über den ROS-Signalweg regulieren, was zu Veränderungen der Zellmorphologie und zur Hemmung der Zellmigration führt. Weitere Experimente bestätigten die obige Vermutung: Die Zugabe von NAC hat eine signifikante hemmende Wirkung auf die durch Leukomenen E induzierten morphologischen Veränderungen (in Richtung verlängerter und reduzierter verlängerter Pseudopodien), und es wurde beobachtet, dass NAC die Induktion des Stressfaserabbaus durch Leukomenen E abschwächte und die Aggregation von Mikrotubuli und Keratinfasern um den Zellkern reduzierte. Diese Phänomene deuten darauf hin, dass die Umstrukturierung des Zytoskeletts und die Veränderungen der Zellmorphologie, die durch Leukomenen E verursacht werden, mit einem Anstieg der ROS-Werte einhergehen. Studien haben gezeigt, dass ROS an den dynamischen Prozessen der Aggregation und Depolymerisation von Mikrofilamenten beteiligt ist. In menschlichen primitiven Chondrozyten fördert ein Anstieg von ROS die oxidative Modifikation von Racl und führt zu Veränderungen in der Zytoskelettstruktur von Aktinzellen; ROS unterbricht das Stressfasernetzwerk und andere Mikrofilamentbündel von Hoden-Sertoli-Zellen (SC) über den ERK-Weg. Darüber hinaus beeinflusst ROS die dynamische Instabilität von Mikrotubuli, reguliert die Organisation des Mikrotubuli-Protein-Zytoskeletts und induziert die Modifikation von Mikrotubuli-Proteinen. Es gibt keine relevanten Berichte über die Korrelation und den Mechanismus zwischen ROS und Keratinfaserpolymerisation. Wir vermuten, dass die durch Leukamenin E verursachte Umstrukturierung des Zytoskeletts durch die Aktivierung von Signalwegen ausgelöst wird, die mit der Umstrukturierung des Zytoskeletts durch den Anstieg der ROS-Werte zusammenhängen. Lai et al. berichteten, dass Naringin einen Anstieg der ROS-Werte in HeLa-Zellen auslöste, den ROS/JNK/Bcl2-Signalweg aktivierte und die Zellproliferation und -migration hemmte. Unsere Forschung bestätigt, dass ROS als Signalmoleküle auf das Zytoskelettsystem wirken und die koordinierte Reorganisation des Zytoskeletts während der Zellbewegung stören können, was zur Hemmung der Zellmigration führt. Der Signalweg, über den Leukamenin E die Zellproliferation hemmt, muss noch eingehender erforscht werden.