Undersøgelse af Leukamenin E-induceret cytoplasmatisk cytoskeletomlægning og migrationshæmning i humane livmoderhalskræft HeLa-celler
Mikrofilamenterne, mikrotubuli og mellemliggende fibre i eukaryote celler er forbundet med deres bindingsproteiner for at danne et meget ordnet tredimensionelt netværk som cytoplasmatisk skeletsystem. De deltager i vigtige cellulære livsprocesser såsom materialetransport, informationsoverførsel, celledeling, cellemigration og vedligeholdelse af cellemorfologi. Cytoskelettets dynamiske proces er stærkt reguleret for at opfylde behovene for cellulære livsaktiviteter, og forstyrrelser i dets samling kan føre til hæmning af cellevækst, celledelingsstop og endda celleapoptose. Nogle antitumorlægemidler kan forstyrre den dynamiske balance i mikrotubuli ved at ændre depolymeriseringen og polymeriseringen af cytoskelettet og derved hæmme celleproliferation og udøve antitumoreffekter. De planteafledte anticancerlægemidler catharanthus-alkaloider og taxaner kan kombineres med β-tubulin, forstyrre den dynamiske proces i mikrotubuli-skelettet og bruges til at behandle en række tumorer, herunder brystkræft, lungekræft, neuroblastom, rhabdomyosarkom, akut leukæmi osv. Forskning og opdagelse af antitumorlægemidler rettet mod cytoskelettet og dets relaterede proteiner er blevet et meget aktivt forskningsfelt.

Reaktive iltarter (ROS) fungerer som signalmolekyler i cellerne og deltager i vigtige cellulære livsprocesser som f.eks. celleproliferation og -differentiering. På grund af ændringer i metaboliske veje i tumorceller øges indholdet af ROS, især H2O2, hvilket gør tumorceller mere følsomme over for ændringer i ROS-niveauer. Derfor er specifikke modifikationer af intracellulære komponenter ved ROS-generering og antioxidantforsvar blevet identificeret som mål for kræftbehandling. Forskning har vist, at ROS genereret af NADPH-oxidase og andre kilder direkte kan modificere mikrofilamenter, mikrotubuli og mellemliggende silkeproteiner, hvilket påvirker deres dynamiske processer for samling og adskillelse, eller omforme cytoskelettet ved at aktivere Rho GTPase opstrøms gennem relaterede signalveje. NADPH-oxidase-medieret intracellulær oxidativ stress spiller også en vigtig regulerende rolle i cytoskeletale sygdomme. I de senere år har forskere vist stor interesse for inddragelsen af ROS i reguleringen af cytoskelettets dynamik.

Der findes over 90 arter af planter i Camellia-slægten i Kina, hvoraf ca. 30 bruges til medicinske formål. Blandt dem var Isodon rubescens engang med i den kinesiske farmakopé og bruges hovedsageligt til behandling af antibakterielle, antiinflammatoriske og antitumorsygdomme. Oridonin, som er den vigtigste aktive ingrediens i Lonicera japonica, er blevet grundigt undersøgt for sin antitumormekanisme, og dens strukturelle modifikationer er indgået i kliniske fase I-forsøg som lægemidler mod leukæmi. Man har opdaget mere end 1300 arter af enantiomere kaempferol-diterpener, som især findes i grene og blade fra planter i Camellia-slægten. Disse forbindelser udviser omfattende anticancer-aktivitet og forventes at føre til opdagelsen af nye antitumor-lægemidler. På nuværende tidspunkt er kun et meget lille antal enantiomere diterpener som arbutin blevet grundigt og systematisk undersøgt for deres anticancermekanismer. Der mangler stadig relateret forskning i andre diterpener af denne type, men der er sket betydelige fremskridt i de senere år. I de senere år har man fundet ud af, at visse enantiomerer af kaempferol-diterpener kan virke på cytoskelet-systemet og udøve anticancer-aktivitet. For eksempel er bakteriocin A direkte rettet mod BubR1-proteinet for at aktivere spindelsamlingskontrolpunktet, forhindre overgang fra midt til sen celle og hæmme den mitotiske fase af leukæmicellerne Raji og Jurkat; Wangzaozin A og epinodosin inducerer omlægning af cytoskelettet (mikrofilamenter, mikrotubuli og intermediære filamenter) i henholdsvis HeLa og HL-60 celler, hvilket er forbundet med deres induktion af celledifferentiering; Leukamenin E kan også inducere keratinfosforylering i HUVEC'er og PLC-celler og derved blokere den normale samling af keratinfibernetværk. Denne artikel fortsætter med at rapportere virkningerne af leukamenin E på omlægningen af tre skeletfibre (mikrofilamenter, mikrotubuli og keratinfibre) i HeLa-celler samt de mulige mekanismer for cellevækst og migrationshæmning. Det giver ledetråde til at belyse de molekylære mekanismer mod kræft i enantiomere kaempferol-diterpenoider og et videnskabeligt grundlag for den videre udvikling og anvendelse af denne forbindelse.

I de senere år har den farmakologiske aktivitet mod kræft af enantiomere kaempferol-diterpener tiltrukket sig stor interesse blandt forskere. Der har været stigende rapporter om anticancermekanismerne for disse forbindelser med forskellige molekylære konfigurationer, og det har vist sig, at deres virkninger på cellulære livsprocesser er mangesidede og demonstrerer multi-mål effekter på molekylært niveau. For eksempel inducerer celleapoptose og differentiering gennem forskellige cellulære signalveje; Målrettet mod peroxidaser I og II, BubR1-protein og kræftprotein AML1-ETO kan det regulere NADPH-oxidaseaktivitet og inducere keratinphosphorylering. Vores forskningsgruppe har successivt rapporteret virkningerne af enantiomere kaempferol-diterpener på cytoskeletalsystemet: leukamenin E kan inducere fosforylering af cellekeratin K8 og K18 og hæmme keratinsamling; Epinodosin og wangzaozin A kan henholdsvis påvirke den dynamiske samling af cytoskelettet i HL-60 og HeLa-celler, hvilket forårsager cytoplasmatisk cytoskeletomlægning, ændrer fordelingen af mikrofilamenter, mikrotubuli og mellemliggende fiberskeletfibre og forstyrrer homeostasen i det cytoplasmatiske cytoskelet-system. Men deres virkningsmekanismer er ikke godt forstået.

I denne artikel undersøgte vi først egenskaberne ved omlægning af HeLa-cellers cytoskelet, fremkaldt af lave koncentrationer af leukamenin E (0,4-1,0 μmol/L). Lav koncentration af leukamenin E ændrede signifikant cellernes morfologi efter langvarig behandling (48 timer og 72 timer), hvilket resulterede i dannelsen af lange striber, en signifikant reduktion i antallet af pseudopodier, forlængelse af pseudopodier og en signifikant ændring i kernemorfologien med en stigning i antallet af "nyreformede kerner". Som bekendt har mikrofilamenter, mikrotubuli og mediumfibre alle den funktion at opretholde cellernes morfologi og deres kerner. Derfor tyder disse ændringer på, at leukomenen E kan forstyrre den dynamiske balance i cytoskelettet og fremkalde en omorganisering af cytoskelettet. Yderligere fluorescensfarvning bekræftede denne spekulation: antallet af cytoplasmatiske stressfibre faldt, mikrotubuli og keratinfibre samledes omkring kernen, arrangementet af mikrotubuli og keratinmellemfibre ændrede sig markant, og nogle mikrotubuli og keratinmellemfibre blev tykkere. Flowcytometrianalyse bekræftede også et fald i sammenhængende mikrofilamenter, en betydelig stigning i aggregerede mikrotubuli og en lille stigning i keratinfiberpolymerisation i HeLa-celler. Dette resultat svarer til vores tidligere rapport om induktion af cytoskeletomlægning i HeLa-celler af det enantiomere diterpenoid wangzaozin A. Behandling af HepG2-, H1299-, PLC- og HUVEC-celler med leukamenin E i høje koncentrationer (2,0 ~ 4,0 μ mol/L) i 24 timer resulterede imidlertid i minimale ændringer i cellemorfologien, hvilket er helt forskelligt fra det mønster af ændringer, der blev observeret efter behandling med lav koncentration. Vi fandt, at høje koncentrationer af leukomenen E kan aktivere ERK-signalvejen i celler, inducere fosforylering af K8-S431/73 og K18-S52, hæmme samlingen af keratinfibre og reducere antallet af keratinfibre. Dette indikerer, at forskellige koncentrationer af leukomenen E kan deltage i reguleringen af forskellige signalveje i celler og forårsage forskellige cellulære responsbegivenheder.

Cytoskelettets dybe involvering i celledeling og migration er tæt forbundet med cellulær karcinogenese og forringelse. Det dynamiske fibernetværk, der består af cytoskelettet og regulatoriske proteiner, er involveret i processen med cellemigration, der manifesterer sig som kontinuerlige ændringer i cellemorfologi, reorganisering af cytoskelettet og retningsbestemt cellebevægelse. Forbindelser, der er rettet mod cytoskelettet, såsom cytochalasin, colchicin og vincristin, hæmmer celleproliferation og migration ved at påvirke samlingen af cytoskelettet. Vores forskning viser, at 0,8 ~ 1,0 μ mol/L leukomenen E kan forstyrre den dynamiske balance i HeLa-cellens cytoskelet, hvilket forårsager betydelig omlægning af cytoplasmatisk cytoskelet, hæmmer cellemigration og reducerer celleproliferationshastigheden ved at blokere cellecyklusdrift. Dette indikerer, at leukomenen E har en vigtig værdi i forskningen og opdagelsen af nye lægemidler mod kræft.

ROS er en type iltholdige frie radikaler, der produceres i levende organismer, og som er mere aktive end molekylær iltkemi, såsom O2, H2O2, - OH osv. Under normale fysiologiske forhold spiller ROS en vigtig rolle som second messenger i bestemmelsen af cellens skæbne og i modificeringen af forskellige signalmolekyler. Forskning har bekræftet, at ROS deltager i signalvejen for ombygning af cytoskelettet, direkte modificerer cytoskelettet eller proteiner relateret til cytoskelettet og er en vigtig regulerende faktor involveret i cytoskelettets struktur og funktion. Tidligere rapporterede vi, at leukomenen E kan øge intracellulære ROS-niveauer og inducere HL-60-celler til at differentiere sig til modne granulocytter ved at regulere NADPH-oxidaseaktivitet i HL-60-celler. I denne undersøgelse øgede behandling af HeLa-celler med 0,4 ~ 1,0 μ mol / L leukomenen E signifikant intracellulære ROS-niveauer, og ROS-indholdet steg signifikant med stigende lægemiddelkoncentration og forlænget behandlingstid. Vi spekulerer i, at ROS kan være en opstrømsbegivenhed for leukomenen E-inducerede cellemorfologiske ændringer, hæmning af cellemigration og omorganisering af cytoskelettet. Leukomenen E kan regulere omlægningen af cytoskelettet gennem ROS-signalvejen, hvilket fører til ændringer i cellemorfologien og hæmning af cellemigrationen. Yderligere eksperimenter bekræftede ovenstående spekulation: Tilsætning af NAC har en signifikant hæmmende effekt på de morfologiske ændringer, der induceres af leukomenen E (mod aflange og reducerede aflange pseudopodier), og det blev observeret, at NAC svækkede induktionen af stressfiberreduktion af leukomenen E og reducerede aggregeringen af mikrotubuli og keratinfibre omkring kernen. Disse fænomener indikerer, at omorganiseringen af cytoskelettet og ændringer i cellernes morfologi forårsaget af leukomenen E er forbundet med en stigning i ROS-niveauerne. Undersøgelser har vist, at ROS er involveret i de dynamiske processer med mikrofilamentaggregering og depolymerisering. I humane primitive kondrocytter fremmer en stigning i ROS oxidativ modifikation af Racl og inducerer ændringer i cytoskeletstrukturen i aktinceller; ROS forstyrrer stressfibernetværket og andre mikrofilamentbundter af testikulære Sertoli-celler (SC) gennem ERK-vejen. Derudover påvirker ROS signifikant den dynamiske ustabilitet af mikrotubuli, regulerer mikrotubuliproteinets cytoskeletorganisation og inducerer mikrotubuliproteinmodifikation. Der findes ingen relevante rapporter om sammenhængen og mekanismen mellem ROS og keratinfiberpolymerisation. Vi spekulerer i, at omlægningen af cytoskelettet forårsaget af leukamenin E udløses af aktiveringen af signalveje relateret til omlægning af cytoskelettet gennem stigningen i ROS-niveauer, men der er behov for yderligere forskning for at bekræfte den specifikke vej. Lai et al. rapporterede, at naringin inducerede en stigning i ROS-niveauer i HeLa-celler, aktiverede ROS/JNK/Bcl2-vejen og hæmmede celleproliferation og -migration. Vores forskning bekræfter, at ROS kan fungere som signalmolekyler på cytoskeletsystemet og forstyrre den koordinerede reorganisering af cytoskelettet under cellebevægelse, hvilket fører til hæmning af cellemigration. Der er behov for yderligere dybdegående forskning i den signalvej, hvorigennem leukamenin E hæmmer celleproliferation.