Screening, identifikation og optimering af fermenteringsbetingelser for højtydende cellulaseproducerende Bacillus subtilis
I de senere år har de globale oliepriser svinget dramatisk med den ubegrænsede brug af fossile brændstoffer, hvilket har haft alvorlige konsekvenser for menneskers dagligdag. Folk er i stigende grad bekymrede over forskning og udvikling af nye alternative energikilder, og cellulosebiomassebrændstof er i øjeblikket anerkendt som den mest værdifulde og lovende vedvarende energikilde. Cellulosebiomasse er den mest udbredte og rigelige biomasse på jorden og består hovedsageligt af cellulose, hemicellulose og lignin. Cellulose, hemicellulose og lignin er dog tæt bundet gennem hydrogen- og kovalente bindinger og har en stædig biomassestruktur. Vi har kun udviklet mindre end 2% celluloseressourcer. Brugen af moderne bioteknologi til at omdanne cellulose til flydende brændstoffer som f.eks. ethanol har et stabilt, vedvarende og forureningsfrit udbytte og har potentiale til at løse problemer som energikrise, miljøforurening og fødevarekrise. Men for at løse dette problem er det mest afgørende at få effektive og billige cellulaser.

Cellulase er en fællesbetegnelse for en gruppe komplekse enzymsystemer, der nedbryder cellulose til monosakkarider eller polysakkarider, primært endoglucanase, exoglucanase og β-1,4-glucosidase. Disse tre enzymer arbejder sammen om at nedbryde cellulosestoffer. På nuværende tidspunkt fokuserer forskningen i cellulaseproducerende bakterier hovedsageligt på svampe som Trichoderma, Penicillium og Aspergillus. Men de fleste af deres cellulaser binder sig til cellemembranen, hvilket er besværligt at bruge, og omkostningerne ved enzymseparation og -ekstraktion er for høje. Desuden har svampecellulaser ikke kun en lang produktionscyklus, men de fleste af de producerede cellulaser skal også være ved højere temperaturer for at udvise god effektivitet. Ved stuetemperatur eller lavere temperaturer er enzymaktiviteten meget lav. Bakterier vokser hurtigere end svampe, kan opnå højere ekspressionsniveauer af rekombinante enzymer og kan producere mere komplekse glycosidhydrolaser til synergistiske reaktioner med enzymatisk hydrolyse. I mellemtiden har bakterier en høj naturlig diversitet og er mere tilbøjelige til at producere varmebestandige og alkalistabile enzymer. Indtil videre omfatter de cellulaseproducerende bakterier, der er blevet grundigt undersøgt, Vibrio, Bacillus, Bacteroides, Clostridium, Erwinia, Ruminococcus og Thermomonas.

Selv om der hidtil er blevet forsket meget i omdannelsen af lignocellulose, står omdannelsen af cellulosebiomasse til bioethanol stadig over for store udfordringer på grund af de høje kommercielle omkostninger ved hemicellulaser og cellulaser. Derfor haster det med at udvikle nye, effektive og billige cellulaser, og opdræt af højtydende cellulasestammer er særligt vigtigt. Screening af højtydende cellulaseproducerende bakteriestammer fra laboratoriebevarede stammer, udførelse af identifikation og forskning i dem, tilvejebringelse af stammekilder til forskning i cellulasepræparation og lægning af et vist fundament for genetisk forbedring, genteknologisk stammekonstruktion og andet arbejde.

 

I denne undersøgelse blev i alt 5 bakteriestammer med høj cellulaseproduktion screenet fra laboratoriekonserverede stammer. Efter morfologiske, fysiologiske og biokemiske egenskaber samt 16S rDNA-analyse blev de identificeret som Bacillus subtilis, 2 stammer af Bacillus subtilis og 3 stammer af Bacillus amyloliquefaciens. Mange svampe og bakterier i naturen kan producere forskellige cellulaser. På nuværende tidspunkt er der mange undersøgelser af svampecellulaser, og cellulaserne på markedet kommer hovedsageligt fra svampe. De cellulaseproducerende bakterier har også tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af deres stærke tilpasningsevne og andre fordele, og de vil sandsynligvis blive en meget vigtig kilde til cellulase i industrien. Blandt dem kan Bacillus subtilis producere og udskille et stort antal ekstracellulære enzymer, hvilket gør den til den vigtigste studerede bakterie. Derudover kan de også danne endosporer og sekundære metabolitter under forhold med langsom vækst i cellulosematrix, hvilket giver dem en konkurrencemæssig fordel. Blandt dem er Bacillus subtilis den mest rapporterede fremragende cellulaseproducerende bakterie, mens Bacillus amyloliquefaciens sjældent er rapporteret.

Forholdet mellem hydrolysecirkeldiameteren og kolonidiameteren på Congo-rød CMC-pladen i denne artikel er større end 4,5, hvor den mindste ZB6 er 4,61 og den maksimale AF1-bakterieforhold når 8,04, hvilket langt overstiger de bakteriestammer med høj enzymaktivitet, der er screenet ved hjælp af den samme metode som rapporteret i eksisterende indenlandsk og udenlandsk litteratur. Den højeste enzymaktivitet, der er rapporteret i litteraturen, var en stamme PX19, der blev isoleret af Tang Hao et al. fra tarmkanalen hos den gigantiske bambuselefant. Forholdet mellem hydrolysecirkeldiameter og kolonidiameter for stammen med den højeste enzymaktivitet var kun 4,83. Efter optimering og screening af de faste fermenteringsbetingelser for cellulaseproduktion af AF1-stammen kan dens højeste filterpapirenzymaktivitet nå 26,904U/g. Derudover fandt det tidligere forskerhold, at AF1-bakterier også kan producere meget aktiv amylase, protease og bredspektrede antibakterielle stoffer. Når den bruges til fodring af kyllinger, kan den forbedre foderudnyttelsen betydeligt, hæmme patogenernes vækst, reducere sygdomsforekomsten og sænke dødeligheden. Det er en stærk stamme med mange funktioner og et stort udviklingspotentiale.