Скрининг, идентификация и оптимизация условий ферментации для получения высокопродуктивной целлюлазы Bacillus subtilis
В последние годы, в связи с неограниченным использованием ископаемого топлива, мировые цены на нефть сильно колеблются, что серьезно сказывается на повседневной жизни человека. Люди все больше озабочены исследованием и разработкой новых альтернативных источников энергии, и топливо из целлюлозной биомассы в настоящее время признано наиболее ценным и перспективным возобновляемым источником энергии. Целлюлозная биомасса - это наиболее широко распространенная и богатая биомасса на Земле, состоящая в основном из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Однако целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин прочно связаны между собой водородными и ковалентными связями, что делает структуру биомассы прочной. Мы освоили лишь менее 2% ресурсов целлюлозы. Использование современных биотехнологий для преобразования целлюлозы в жидкое топливо, такое как этанол, дает стабильные, возобновляемые и не загрязняющие окружающую среду урожаи и способно решить такие проблемы, как энергетический кризис, загрязнение окружающей среды и продовольственный кризис. Но для решения этой проблемы самое важное - получить эффективные и недорогие целлюлазы.

Целлюлаза - это собирательный термин для обозначения группы сложных ферментных систем, разлагающих целлюлозу с образованием моносахаридов или полисахаридов, в основном включающих эндоглюканазу, экзоглюканазу и β -1,4 глюкозидазу. Эти три фермента работают вместе, разлагая целлюлозные вещества. В настоящее время исследования бактерий, продуцирующих целлюлазу, в основном сосредоточены на грибах, таких как Trichoderma, Penicillium и Aspergillus. Однако большинство их целлюлаз связываются с клеточной мембраной, что неудобно для использования, а стоимость выделения и экстракции фермента слишком высока. Кроме того, грибковые целлюлазы не только имеют длительный цикл производства, но и большинство производимых целлюлаз должны работать при более высоких температурах для достижения хорошей эффективности. При комнатной или более низкой температуре активность фермента очень низкая. Бактерии растут быстрее грибов, могут получать более высокие уровни экспрессии рекомбинантных ферментов и производить более сложные гликозидные гидролазы для синергетических реакций ферментативного гидролиза. Между тем, бактерии отличаются высоким природным разнообразием и с большей вероятностью производят термостойкие и щелочеустойчивые ферменты. К числу бактерий, продуцирующих целлюлазу, которые были подробно изучены, относятся Vibrio, Bacillus, Bacteroides, Clostridium, Erwinia, Ruminococcus и Thermomonas.

К настоящему времени проведено большое количество исследований по переработке лигноцеллюлозы, однако превращение целлюлозной биомассы в биоэтанол по-прежнему сталкивается со значительными трудностями из-за высокой коммерческой стоимости гемицеллюлаз и целлюлаз. Поэтому разработка новых, эффективных и недорогих целлюлаз является неотложной задачей, а селекция высокопродуктивных штаммов целлюлаз - особенно важной. Отбор высокопродуктивных штаммов бактерий, продуцирующих целлюлазу, из сохранившихся в лаборатории штаммов, их идентификация и изучение, получение штаммов-источников для исследования получения целлюлазы, а также создание определенной основы для генетического улучшения, конструирования генно-инженерных штаммов и других работ.

 

В этом исследовании из лабораторных консервированных штаммов было отобрано 5 штаммов бактерий с высокой продукцией целлюлазы. После морфологических, физиологических и биохимических характеристик, а также анализа 16S рДНК они были идентифицированы как Bacillus subtilis, 2 штамма Bacillus subtilis и 3 штамма Bacillus amyloliquefaciens. Многие грибы и бактерии в природе могут продуцировать различные целлюлазы. В настоящее время проводится множество исследований грибковых целлюлаз, и целлюлазы, представленные на рынке, в основном происходят из грибов. Бактерии, производящие целлюлазу, также привлекли к себе пристальное внимание из-за их сильной адаптивности и других преимуществ, и они, вероятно, станут очень важным источником целлюлазы в промышленности. Среди них Bacillus subtilis может производить и выделять большое количество внеклеточных ферментов, что делает ее основной изучаемой бактерией. Кроме того, они могут образовывать эндоспоры и вторичные метаболиты в условиях медленного роста в целлюлозном матриксе, что дает им конкурентное преимущество. Среди них Bacillus subtilis является наиболее известной бактерией, продуцирующей отличную целлюлазу, в то время как Bacillus amyloliquefaciens встречается редко.

Отношение диаметра круга гидролиза к диаметру колонии на пластине с КМЦ Конго Ред в данной статье превышает 4,5, при этом минимальный показатель ZB6 составляет 4,61, а максимальный показатель бактерий AF1 достигает 8,04, что значительно превышает показатели штаммов бактерий с высокой ферментной активностью, исследованных тем же методом и представленных в существующей отечественной и зарубежной литературе. Наибольшей ферментной активностью, о которой сообщалось в литературе, обладал штамм PX19, выделенный Танг Хао и др. из кишечного тракта гигантского бамбукового слона. Отношение диаметра круга гидролиза к диаметру колонии штамма с самой высокой активностью фермента составляло всего 4,83. После оптимизации и скрининга условий твердой ферментации для производства целлюлазы штаммом AF1 его наивысшая ферментативная активность на фильтровальной бумаге достигла 26,904 Ед/г. Кроме того, предыдущая исследовательская группа обнаружила, что бактерии AF1 могут также производить высокоактивную амилазу, протеазу и антибактериальные вещества широкого спектра действия. При использовании в кормлении цыплят он может значительно повысить коэффициент конверсии корма, подавить рост патогенов, снизить заболеваемость и смертность. Это мощный штамм с множеством функций и большим потенциалом для развития.