Endofitik bakterilerin dağılımı ve Xiangmaidong'da farklı büyüme aşamalarında steroidal saponin üreten suşların ön taraması
Hubei maidong Liriope spicata var. prolifera Y.T. Ma olarak da bilinen Xiangmaidong, Çin Halk Cumhuriyeti Farmakopesi'nde (2010 baskısı) Shanmaidong'un kaynak bitkilerinden biridir. Steroid saponinler ana aktif bileşenidir ve sapogenin temel iskeleti spirostan türevine aittir (27 karbon atomundan oluşur). Spirostan yapısındaki C25 konfigürasyonuna ve F halkasının siklik durumuna göre, aşağıdaki dört ana türe ayrılabilir: spirostanol (C25 S konfigürasyonudur), izosterostanol (C25 R konfigürasyonudur) ve furostanol (F halkası açık zincirli bir türevdir), modifiye spirostanol alkolleri (F halkası beş üyeli bir tetrahidrofuran halkasıdır). Ophiopogon japonicus'tan, her ikisi de C25 (S) izomeri olan ana glikozitler diosgenin ve ruscogenin olmak üzere on dört tip steroidal saponin izole edilmiştir. Bunlar arasında, Ophiopogon japonicus'taki saponin C (Ls-S3) içeriği nispeten yüksektir. Steroid saponinler çok sayıda farmakolojik aktiviteye sahiptir ve kimyasal olarak sentezlenebilen birkaçı dışında, çoğunlukla kimyasal ekstraksiyon yoluyla doğrudan geleneksel Çin tıbbi malzemelerinden elde edilirler. Xiangmaidong steroid saponinleri de bir istisna değildir. Bununla birlikte, uzun üretim döngüleri, tarlada sürekli kırpma engelleri, düşük saponin içeriği, yüksek ekstraksiyon maliyetleri ve önemli çevre kirliliği gibi sorunlar nedeniyle, Xiangmaidong steroidal saponinlerinin sürdürülebilir üretimi ve tedariki kısıtlıdır. Bu nedenle, saponinleri büyük miktarlarda hazırlamak için yeni yollar aramak gerekmektedir.

Daha önce, Dianzhong ve Huazhong binalarından steroidal saponin üretebilen endofitik bakterilerin izole edildiğini bildiren çalışmalar vardı. Bundan esinlenen araştırma ekibimiz, Xiangmaidong'dan steroidal saponinleri metabolize eden ve üreten endofitik bakteri suşlarını izole etmeye ve keşfetmeye çalışmıştır. Saf kültür yöntemleri ve 16SrDNA-PCRDGGE teknolojisini kullanarak, Xiangmaidong'un ilk ortaya çıkış, hızlı büyüme ve olgun hasat dönemlerinde örneklerdeki (yumru veya kökler) endofitik bakterilerin dağılımını analiz ettik ve tanımladık. Aynı zamanda, hedef suşları elde etmek ve steroidal saponinlerin "fabrika, ölçek ve hızlı" üretimi için teorik destek sağlamak amacıyla, elde edilen saf kültür suşlarının saponin üretim yeteneğini ön değerlendirmek için renk reaksiyonu, TLC ve HPLC yöntemleri kullanılmıştır.

Bu çalışmada, geleneksel mikrobiyal saf yetiştirme yöntemleri kullanılarak, farklı büyüme aşamalarındaki Xiangmaidong kök yumruları ve lifli köklerinden 15 cins ve 22 tür endofitik bakteri izole edilmiştir. Bunlar arasında 4 Bacillus türü ve 4 Staphylococcus türü, 2 Pseudomonas türü ve Salmonella, Enterobacter, Pseudoxanthomonas, Morganella, Agrobacterium, Microbacterium, Porphyromobacter, Acinetobacter, Lysinibacter ve Sphingosine dahil olmak üzere kalan 12 cins vardı. Sphingomonas, Sphingomonas ve Curtobacterium cinslerinde sadece birer bakteri türü bulunmaktadır.

Bu çalışma, 16SrDNA PCR DGGE tanımlaması yoluyla, Xiangmaidong'un endofitik bakteri topluluğu yapısının, ilk ortaya çıkış dönemi, hızlı genişleme dönemi ve yumrularının olgun hasat dönemi boyunca temelde aynı olduğunu ve suş gruplarında çok az farklılık olduğunu ortaya koymuştur. Dizi hizalaması yoluyla, izole edilen dizilerden 3 Bacillus türü ve 3 Staphylococcus türü, 2 Serratia türü ve 2 Pseudomonas türü dahil olmak üzere 15 cins ve 21 bakteri türü ve Pseudomonas, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Porphyromobacter, Curtobacterium, Enterobacter, Methylobacterium, nitrojen sabitleme dahil olmak üzere kalan 11 cins tanımlanmıştır. Sadece bir Azotobacter, Microbacterium ve Pseudoclavibacter suşu bulunmaktadır. Yukarıda bahsedilen 22 saf endofitik bakteri suşu ile karşılaştırıldığında, DGGE 7 yeni cins tanımlamıştır: Serratia, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Methylobacterium, Azotobacter ve Pseudomonas.

Bu çalışmada, saf yetiştirilebilir endofitik suşların saponin üretme kabiliyeti değerlendirilmiş ve steroidal saponin üretme açısından önemli özelliklere sahip üç bakteri suşu, Pseudoxanthomonas mexicana, Staphylococcus caprae ve Microbacterium testaceum, önceden tanımlanmıştır. HPLC tespit sonuçlarına göre, bu üç endofitik bakterinin tümü 15.98, 57.64 ve 75.19 dakikalık zaman noktalarında karakteristik pikler göstermiştir, bu da fermantasyon ürünlerindeki en az üç saponinin aynı yapıya sahip olabileceğini ve bunun daha fazla deneysel doğrulama gerektirdiğini göstermektedir. Şu anda, steroidal saponinleri tespit etmek için iki ana strateji vardır: biri doğrudan tespit, diğeri ise bölünmüş saponinlerin kalitatif ve kantitatif analizi yoluyla dolaylı tespittir. Araştırmacılar Dioscorea nipponica, ararot, sisal ve zambak tomurcuklarındaki dioscin içeriğini belirlemek için HPLC yöntemini kullanmışlardır. Bu deneyde Xiangmaidong steroidal saponinlerinin standart ve izole edilmiş saf örneklerinin bulunmaması nedeniyle, hazırlanan Xiangmaidong kökü steroidal saponinleri (karışım) geçici olarak pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Aynı tespit koşulları altında aynı zaman noktasında karakteristik piklerin ortaya çıkıp çıkmayacağı karşılaştırılarak, endofitik bakterilerin glikozit üretim özellikleri önceden tanımlanmıştır. Gelecekte, laboratuvarımız fermantasyon ürünü saponin özütünü daha da ayıracak ve saflaştıracak ve daha doğru karakterizasyon için kütle spektrometresi, nükleer manyetik rezonans ve diğer yöntemleri kullanacaktır.

16SrDNA V6 ～ V8'in yüksek değişken bölgesinin DGGE analizine dayanan ve steroidal saponin üretebilen saf kültürlenmiş endofitik bakterilerin tarama sonuçlarıyla birleştirilen bu deney, bir fenomen buldu: Xiangmaidong'un kök yumrularının hızlı genişleme döneminde ve olgun hasat döneminde, Meksika psödo-sarı psödomonas P. kök yumrularından tespit edilebilir Kök yumrularının ilk aşamasında mexicana'nın varlığı tespit edilmedi. Xiangmaidong'un kök yumrularındaki steroidal saponinlerin biyokütlesinin ve içeriğinin başlangıç aşamasından itibaren kademeli olarak arttığı ve hasadın hızlı genişleme ve olgunluk aşamalarında zirveye ulaştığı doğrulanmıştır. Bu fenomen Meksika'daki Pseudomonas aeruginosa'nın Ophiopogon japonicus yumrularında steroidal saponinlerin birikiminde pozitif korelasyonlu bir rol oynadığı anlamına mı gelmektedir? Bu da daha fazla deneysel doğrulama gerektirmektedir.