Wuyao yapraklarındaki altı flavonoidin ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi ile eşzamanlı tayini
Kafur ailesine ve Piper cinsine ait bir bitki olan Lindera aggregata (Sims) Kosterm, anti-enflamatuar, analjezik, antioksidan ve anti-tümör etkilere sahiptir. Esas olarak Çin'in güneydoğu kıyı eyaletlerinde üretilir, Zhejiang Eyaletindeki Tiantai İlçesi en ünlüsüdür, bu nedenle Tiantai Wuyao olarak adlandırılır. 2018 yılında Zhejiang'daki yeni "Zhejiang Sekiz Lezzeti "nden biri olarak seçilmiştir. Modern farmakolojik araştırmalar, kara ilacın merkezi sinir sistemi ve kardiyovasküler sistem üzerinde immünomodülatör etkileri olduğunu ve pazar beklentilerini genişlettiğini göstermiştir. Ancak, Wuyao'nun tıbbi kısımları yavaş büyür ve kaliteli tıbbi bitki işleme gereksinimlerini karşılaması genellikle 8-10 yıl alır. Büyüme döngüsü sırasında, kök ve yaprak kısımları genellikle atılır ve bu da düşük kaynak kullanımına neden olur. Zhejiang'ın halk bölgelerinde, Wuyao yaprakları genellikle akut selülit, romatoid artrit ve diğer iltihapları tedavi etmek için kullanılır ve ayrıca lipid düşürücü, karaciğer koruyucu ve diğer sağlık yararları için çay içecekleri haline getirilir. Önceki çalışmalar Wuyao yaprağı ekstrelerinin belirli bir lipit düşürücü etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Araştırma ekibi, Wuyao yaprağı özleri üzerinde farmakolojik bir korelasyon çalışması yürüttü ve hiperlipidemi ve osteoporoza karşı belirli bir etki mekanizmasına sahip olduklarını buldu. Aynı zamanda, erken aşamada Wuyao yaprakları üzerinde sistematik kimyasal bileşen ayrımı ve ekstraksiyonu da gerçekleştirilmiştir. Wuyao yapraklarının etanol özütünden ilk kez altı flavonoid izole edilmiş ve bunlar şu şekilde tanımlanmıştır: kaempferol-3-O - α - L-rhamnoside (1), quercetin (2), kaempferol-3-O - β - D-xyloside (3), kaempferol-3-O - α - L-arabinofuranoside (4), kaempferol-3-O - (2 ″ -3-O-trans-3-O-p-3-O-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (5), kaempferol-3-O - (2 ″, 4 ″ -3-O-di-3-3-O-3-3-O-di-3-glucoside) O-trans-3-O-p-3-O-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (6), kimyasal yapısı Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şu anda, Wuyao yapraklarının kalite değerlendirmesine ilişkin ilgili araştırma raporları bulunmaktadır. Yi ve arkadaşları, Hunan Eyaletindeki farklı kökenlerden gelen Wuyao yapraklarındaki dört flavonoidin içeriğini belirlemek için HPLC kullanmıştır. Sun ve arkadaşları, Wuyao yaprak ekstraktlarındaki toplam flavonoid içeriğini belirlemek için UV spektrofotometresini kullanmış ve ekstraksiyon sürecini optimize etmek amacıyla toplam flavonoidlerin ekstraksiyonu için ilgili faktörleri araştırmıştır. Aynı zamanda, Sun ve arkadaşları farklı kökenlerden gelen Wuyao yapraklarındaki dört seskiterpenoid laktonun içeriğini belirlemek için HPLC kullanmıştır. Ancak bunlar, içerik belirlemede yüksek verimlilik ve doğruluktan yoksun olan geleneksel tespit yöntemleridir. Kütle spektrometresi teknolojisinin ilerlemesiyle birlikte, yüksek verimlilik, yüksek özgüllük ve yüksek hassasiyete sahip ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi teknolojisi geliştirilmiştir. Kromatografi tandem kütle spektrometrisi (UPLC-MS/MS) geleneksel Çin tıbbi malzemelerinin kalitesini tespit etmek için önemli bir analitik yöntem haline gelmiştir. Bu nedenle, bu çalışmada farklı kökenlerden gelen Wuyao yapraklarındaki altı ana flavonoidi kantitatif olarak incelemek için UPLC-MS/MS teknolojisi kullanılacak ve Wuyao yapraklarının iç kalite kontrolüne bilimsel temel sağlamak amacıyla analiz ve değerlendirme için entropi ağırlığı - α - L - yaklaşık ideal çözüm sıralama yöntemi (TOPSIS) birleştirilecektir.

 

Ekstraksiyon koşullarının seçimi. Bu çalışmada, UPLC-MS/MS yöntemi kaempferol-3-O - α - L-rhamnoside (1), quercetin (2), kaempferol-3-O - β - D-xyloside (3) olmak üzere altı indikatör bileşiğin içeriğini eş zamanlı olarak belirlemek için kullanılmıştır, kaempferol-3-O - α - L-arabinofuranoside (4), kaempferol-3-O - (2"- trans - p-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (5) ve kaempferol-3-O - (2", 4"- di trans - p-coumaroyl) - α - L-rhamnoside (6), Wuyao yapraklarında 10 dakika içinde. Metanol konsantrasyonları sırasıyla 30%, 50% ve 70% idi. Spektrum analizine dayanarak, en iyi ekstraksiyon etkisi için 70% metanol seçilmiştir. Aynı zamanda, ısıtma reflü ve ultrasonik ekstraksiyon yöntemleri arasında bir karşılaştırma yapılmıştır. İçerik sonuçlarına göre, elde edilen ekstraksiyon oranları karşılaştırılabilirdi. Zaman ve sarf malzemesi maliyetleri göz önünde bulundurularak ultrasonik ekstraksiyon benimsenmiştir.
Kromatografi kütle spektrometresi koşulları. Bu çalışmada üç mobil faz sistemi incelenmiştir: asetonitril su, asetonitril-0.1% formik asit su ve asetonitril-0.1% amonyum format su. Altı flavonoidin pik alanı ve pik şekli, uygun mobil faz sistemini belirlemek için değerlendirme göstergeleri olarak kullanılmıştır. Mobil faz olarak asetonitril su seçildiğinde, kaempferol-3-O - (2"- trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnoside ve kaempferol-3-O - (2", 4"- di-trans-pcoumaroyl) - α - L-rhamnoside bileşiklerinde kuyruklanma fenomeni olduğu; asetonitril 0.1% amonyum format suyu mobil faz olarak seçildiğinde, kuersetin 3-O - α - L-arabinofuranosid hafif kuyruklanma sergiler; Mobil faz olarak asetonitril 0.1% formik asit suyu seçildiğinde, altı bileşiğin tümünün pik şekilleri nispeten simetriktir. Bu nedenle, mobil faz sistemi olarak asetonitril 0.1% formik asit su seçilmiştir. Kütle spektrometresi koşullarının seçiminde, çalışmada altı hedef bileşiğin içeriğini belirlemek için pozitif ve negatif iyon modları kullanılmıştır. Hedef bileşiklerin daha iyi kararlılığa, daha yüksek yanıt değerlerine ve daha iyi pik şekillerine sahip olmasını sağlamak için, tekrarlanan çok sayıda deney, tespit için negatif iyon tarama modunun kullanılmasının, altı flavonoid bileşiği daha kararlı hale getirebileceğini, tespit koşulları altında daha iyi pik şekilleri ve yanıt değerleri sağlayabileceğini göstermiştir. Aynı zamanda, kromatografi-kütle spektrometresi koşullarının araştırılması sırasında, Şekil 2'deki iyon kromatogramından çıkarılan flavonoid 2 ve 5'in alıkonma süreleri temelde aynıydı. Geleneksel HPLC analiz teknikleri ile karşılaştırıldığında, kütle-yük oranı analizine dayanan kromatografi-kütle spektrometresi pik-pik ayrımına dayanmaz ve kısa sinyal toplama süresine ve yüksek hassasiyete sahiptir. Bu nedenle, bu çalışmada, Wuyao yapraklarındaki altı flavonoidi eş zamanlı olarak belirlemek için daha fazla avantaja sahip olan UPLC-MS/MS analiz teknolojisi kullanılmıştır.
Sonuç analizi. Bu çalışmada Çin'deki 10 Wuyao üretim alanından tıbbi örnekler toplanmış ve Wuyao yapraklarındaki altı kimyasal bileşenin içeriğini eş zamanlı olarak belirlemek için UPLC-MS/MS teknolojisi kullanılmıştır. Entropi ağırlıklı TOPSIS yöntemi, 10 üretim alanından altı bileşiği kapsamlı bir şekilde analiz etmek ve değerlendirmek için kullanılmıştır. Kapsamlı sıralama aşağıdaki gibi olmuştur: Tiantai, Zhejiang>Jinhua, Zhejiang>Changsha, Hunan>Ningde, Fujian>Kunming, Yunnan>Tonglu, Zhejiang>Guilin, Guangxi>Yingtan, Jiangxi. Sonuçlar, Tiantai, Zhejiang'daki Wuyao yapraklarının kapsamlı kalitesinin nispeten yüksek olduğunu göstermiştir; bu da Tiantai, Zhejiang'ın gerçek bir Wuyao tıbbi malzeme üretim alanı olduğuna dair geleneksel inançla ilgilidir. Aynı zamanda, Compendium of Materia Medica'daki Wuyao için Tiantai'nin kazanan olduğu kaydını da doğrulamaktadır; Geleneksel Çin Tıbbı Sözlüğü, Wuyao üretiminin Zhejiang'daki en büyük üretim olduğunu ve Tiantai, Zhejiang'da üretilen ürünlerin kalitesinin en iyi olduğunu, bu nedenle "Tiantai Wuyao" veya "Tai Wuyao" olarak adlandırıldığını kaydetmektedir. Aynı zamanda, değerlendirme sonuçları farklı kökenlerden gelen Wuyao yapraklarındaki altı ana flavonoidin içeriğinde önemli farklılıklar olduğunu ve aynı ildeki farklı şehirlerden gelen Wuyao yapraklarında da önemli farklılıklar olduğunu yansıtmaktadır. Bu durum, Wuyao'nun farklı ekim alanlarına ve farklı ekolojik ortamlara giriş kaynakları ile ilgili olabilir.
Şu anda, Wuyao Ye yeni bir kaynak gıda olarak onaylanmıştır, bu nedenle ürün geliştirme araştırılmaya devam edecektir. Bu çalışma, kullanımı kolay, hassasiyeti, kararlılığı ve tekrarlanabilirliği iyi olan ve Wuyao Ye'deki altı flavonoidin içeriğini aynı anda belirleyebilen bir yöntem oluşturmuştur. Wuyao Ye'deki ana flavonoidlerin nicel analizi ve kapsamlı değerlendirmesi için kullanılabilir ve kullanılan entropi ağırlıklı TOPSIS yöntemi de tıbbi değeri olan diğer şifalı bitkilerin kalitesini değerlendirmek için teorik bir temel sağlar.