Akt/mTOR yolağını düzenleyen Shengcao fenolün glioma hücrelerinde otofaji üzerine etkisi. Glioblastoma multimodal (GBM), merkezi sinir sisteminde en sık görülen, yüksek malignite ve invazivliğe sahip malign tümördür. Cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi ile kapsamlı tedaviden sonra bile nüks ve metastaz riskiyle karşı karşıyadır. Temozolomid (TMZ) klinik uygulamada ilk basamak anti glioma ilacıdır. Ancak, kan toksisitesi gibi ciddi advers reaksiyonları nedeniyle, bu durum TMZ'nin klinik kullanımını büyük ölçüde sınırlamakta ve etkinliğini ciddi şekilde etkilemektedir. Bu nedenle, etkili ve düşük toksisiteli yeni anti glioma ilaçlarının araştırılması büyük önem taşımaktadır.
Otofaji, programlanmış bir hücre ölüm mekanizması olarak dinamik bir bozunma ve dolaşım sistemidir. Otofaji, üç durumu içeren dinamik bir süreçtir: fagoforlar, otofagozomlar ve otolizozomlar. Son yıllarda yapılan araştırmalar, hücresel otofajideki anormalliklerin tümörlerin oluşumu ve gelişimiyle yakından ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Gliomlarda, otofajinin anormal düzenlenmesi tümör büyümesini teşvik edebilirken, otofajiye müdahale etmek glioma hücre ölümüne yol açabilir ve böylece tümör ilerlemesini engelleyebilir. Bu nedenle, otofajiyi hedef alan yeni glioma tedavi yöntemlerinin araştırılması oldukça umut verici bir araştırma yönüdür.
Eridiktiyolün (ERD) kimyasal yapısı Şekil 1'de gösterilmiştir. Sebze ve meyvelerde, özellikle de en bol bulunduğu narenciye suyunda yaygın olarak bulunan doğal bir yenilebilir flavonoiddir. Araştırmalar, resveratrolün antioksidan, anti-enflamatuar ve anti-tümör etkileri de dahil olmak üzere birçok farmakolojik etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Önceki araştırmalarımız resveratrolün apoptozu indükleyebildiğini ve glioma hücrelerinin metastazını inhibe edebildiğini bulmuştur, ancak otofaji üzerindeki etkisi henüz incelenmemiştir. Bu çalışmanın amacı, resveratrolün glioma hücrelerinin proliferasyonu ve otofajisi üzerindeki etkilerini deneyler yoluyla araştırmak ve olası moleküler mekanizmaları daha fazla araştırarak resveratrolün gliomaya karşı farmakolojik mekanizmasını aydınlatmak için bir temel sağlamaktır.

 

Gliomlar, en yüksek insidans ve mortalite oranlarına sahip, güçlü invazivlik, hızlı malign progresyon ve medyan sağkalım süresi bir yıldan az olan son derece düşük kür oranları ile karakterize merkezi sinir sistemi tümörleridir. GBM'deki yüksek invaziv büyümenin biyolojik özellikleri nedeniyle, ameliyat sırasında tam tümör rezeksiyonunu garanti etmek neredeyse imkansızdır ve ameliyat sonrası nüks oranı son derece yüksektir. Bu nedenle, klinik uygulamada genellikle cerrahi+radyoterapi ve kemoterapiden oluşan kapsamlı bir tedavi yaklaşımı benimsenmektedir.

Şu anda glioma için ideal bir terapötik ilaç bulunmamaktadır. Klinik uygulamada yaygın olarak kullanılan ilaçlar temel olarak biyolojik alkilleyici ajanları, hedefe yönelik anti-tümör ilaçları ve immün kontrol noktası inhibitörlerini içerir. TMZ, GBM tedavisinde birinci basamak kemoterapi ilacıdır, ancak seçiciliği zayıftır, ilaç direncine eğilimlidir ve güçlü yan etkileri vardır, bu da genellikle tatmin edici olmayan tedavi sonuçlarına neden olur. Hedefe yönelik anti-tümör ilaçlar ve immün kontrol noktası inhibitörleri, yüksek seçicilik ve minimum yan etki özelliklerine sahiptir ve yavaş yavaş yurtdışında ana akım anti-tümör ilaçlar haline gelmiştir. Bununla birlikte, hedefe yönelik ilaçlar ve bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri pahalıdır ve uzun süreli kullanım hastalar üzerinde ağır bir ekonomik yük ve baskı oluşturmaktadır. Bu nedenle, etkili, düşük toksisiteli ve uygun fiyatlı yeni anti glioma ilaçları arayışı şu anda glioma araştırmaları alanında sıcak bir konudur. Ülkemizdeki geleneksel Çin tıbbı ve doğal aktif ürünler bol kaynaklara, çok sayıda türe, nispeten küçük toksik yan etkilere sahiptir ve anti-tümör tedavisinde benzersiz avantajlara sahip olan geniş boyutlar, çok seviyeli ve çok hedefli kapsamlı etkiler özelliklerine sahiptir. Bu nedenle, doğal aktif ürünlerden ve geleneksel Çin tıbbından etkili anti glioma bileşenlerinin araştırılması, mevcut ikilemi çözmek için etkili bir yol olabilir.

Doğal bir flavonoid olan ERD, çok çeşitli biyolojik aktiviteleri nedeniyle dikkat çekmiş ve araştırmalara konu olmuştur. Geçmişte, ERD üzerine yapılan araştırmalar esas olarak anti-enflamatuar ve antioksidan etkilere odaklanmıştır, ancak son çalışmamız resveratrolün glioma hücrelerinin metastazını önemli ölçüde inhibe edebileceğini ve apoptozunu indükleyebileceğini bulmuştur. Ayrıca, Tang ve arkadaşlarının çalışması nazofarenks karsinomu CNE1 hücrelerinde ERD'nin otofaji aracılığı ile hücre proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe ettiğini göstermiştir. Wang ve arkadaşları ERD'nin otofajiyi düzenleyerek sıçan serebral iskemi-reperfüzyon hasarında koruyucu bir rol oynadığını bulmuştur. Yukarıdaki araştırma sonuçları, ERD'nin hücresel otofaji üzerinde düzenleyici bir etkiye sahip olduğunu ve otofajiyi etkileyerek anti-kanser etkiler gösterebileceğini göstermektedir.

Bu çalışmada ERD'nin gliomlarda otofaji üzerindeki etkisi araştırılmıştır. İlk olarak, CCK-8 reaktifi ve klon oluşum deneyleri ile ERD'nin glioma hücreleri üzerinde iyi bir inhibitör etkiye sahip olduğunu doğruladık, bu da önceki araştırma sonuçlarımızla tutarlıdır. Ardından, ERD'nin gliomlarda otofaji üzerinde bir etkisi olup olmadığını araştırmak için otofaji ile ilgili proteinler LC3, Beclin 1 ve ATG5'in ekspresyon seviyelerini ölçtük ve floresan yoluyla otofagozom sayısını gözlemledik. Sonuçlar, ERD ile tedavi edilen glioma hücrelerinde LC3B, Beclin 1 ve ATG5 ekspresyonunun önemli ölçüde arttığını ve otofagozom sayısının da önemli ölçüde yükseldiğini gösterdi. ERD glioma hücrelerinde otofajiyi indükler. Otofaji üç durumu içeren dinamik bir süreçtir: otofagozomlar, otofagozomlar ve otolizozomlar. Hücreler otofajiye girdiğinde, önce otofagozomlar oluşur, bunlar daha sonra lizozomlarla birleşerek otolizozomları oluşturur ve ardından içlerinde bulunan proteinleri ve diğer maddeleri bozar. Kırmızı yeşil floresan proteini ifade eden stabil hücreler oluşturmak için hücre hattını GFP-mRFP-LC3B çift floresan plazmidi ile transfekte ettik. GFP floresan proteininin düşük pH koşulları altında floresan yoğunluğunun azalması özelliğini kullanarak otofaji akışını gözlemledik. Otofagozomlar, otolizozomları oluşturmak için lizozomlarla birleştiğinde, veziküllerin içindeki pH değeri düşer ve kırmızı ve yeşil floresan kombinasyonundan sonra hücreler kırmızımsı bir floresan gösterir. Aksi takdirde, sarıya dönme eğilimindedirler. Sonuçlar, ERD tedavisinden sonra glioma hücrelerinin parlak sarı floresan sergilediğini ve otofagozomlar için bir substrat olan P62 proteininin ekspresyonunun arttığını göstermiştir. Bununla birlikte, ERD otofaji indükleyicisi RAP ile birlikte muamele edildiğinde, ERD'nin etkisi kısmen tersine dönmüştür. Yukarıdaki deneysel sonuçlar ERD'nin glioma hücrelerinde otofagozom oluşumunu teşvik ettiğini, ancak otofajik akışı engellediğini göstermektedir.

Akt/mTOR sinyal yolu hücresel otofajide önemli bir düzenleyici rol oynar ve tümör tedavisi için potansiyel bir hedeftir. Bu nedenle, ERD'nin glioma hücrelerinde otofajiyi etkileyen potansiyel mekanizmasını daha fazla araştırmak için, ERD'nin Akt/mTOR yolağı ile ilgili proteinlerin ekspresyonu üzerindeki etkisini inceledik. Sonuçlar ERD'nin p-Ak ve p-mTOR ekspresyonunu inhibe edebildiğini ve bu etkinin Akt agonisti 740 Y-P tarafından kısmen tersine çevrildiğini gösterdi. Bu da ERD'nin Akt/mTOR yolunu aşağı regüle ederek glioma hücrelerinin otofaji sürecini etkileyebileceğini düşündürmektedir. Son olarak, ERD'nin glioma otofajisi üzerindeki etkisini çıplak fare subkutan transplant tümör modeli kullanarak in vivo olarak gözlemledik ve deneysel sonuçlar in vitro ve in vivo sonuçlarla tutarlıydı.

Özetle, bu çalışma ERD'nin glioma hücrelerinde otofaji üzerindeki etkisini ilk olarak araştırmıştır. ERD'nin Akt/mTOR yolunu kısmen inhibe edebileceği, otofaji ile ilgili proteinler ATG5, Beclin1, LC3 ve P62'nin ekspresyonunu düzenleyebileceği, glioma hücrelerinin otofaji sürecini etkileyebileceği, böylece glioma hücre proliferasyonunu inhibe edebileceği ve nihayetinde anti glioma etkileri gösterebileceği bulunmuştur. Bununla birlikte, ERD'nin otofajik akışı düzenlediği moleküler mekanizma bu çalışmada tam olarak aydınlatılamamıştır ve daha fazla araştırma gerektirmektedir.