Fare testis Sertoli 15P-1 hücrelerinde D-galaktoz kaynaklı hasara karşı Nrf2 sinyal yolunu aktive eden icariinin koruyucu etkisi üzerine ön çalışma
Ekonominin ve toplumun sürekli gelişmesi ve insanların hayatta kalması üzerindeki baskının artmasıyla birlikte kısırlık küresel bir sorun haline gelmiştir. Araştırmalar, dünya çapında çiftlerin yaklaşık 15%'sinin kısırlıktan muzdarip olduğunu, erkek faktörlerinin yaklaşık 50%'sini oluşturduğunu ve mekanizmanın henüz tam olarak anlaşılmadığını ortaya koymuştur. Testis Sertoli Hücreleri, spermatogenik hücrelere bağlı tek somatik hücreler olarak, spermatogonial kök hücreleri, spermatogonia ve çeşitli seviyelerde spermatogenik hücreleri yapısal olarak çevreler ve Occludin ve Claudin-1 gibi çeşitli sıkı bağlantı proteinleri aracılığıyla bir kan testis bariyeri oluşturur. Araştırmalar, testis destek hücrelerinin, spermatogonyal kök hücrelerin çoğalmasını ve farklılaşmasını düzenleyen ve sperm oluşumunu teşvik eden glial hücre hattından türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF), kemik morfogenetik protein-4 (BMP4) ve kök hücre faktörü (SCF) gibi çeşitli büyüme faktörleri salgıladığını göstermiştir. Başka bir çalışmada, hamilelik sırasında altı değerlikli kroma maruz kalan erkek sıçanların, yetişkinlikten sonra destek hücrelerinde sıkı bağlantı proteinleri Occludin ve Claudin-1'in ekspresyonunda aşağı regülasyon gösterdiği, bunun da spermatojenik hücrelerin apoptozunda artışa ve sperm üretiminde bozulmaya yol açtığı bulunmuştur. Isı stresi uyarımı altında, sığır testis Sertoli hücreleri hasar görür ve GDNF ve SCF mRNA seviyeleri aşağı doğru düzenlenerek sperm işlev bozukluğuna yol açar. Bu nedenle, destek hücrelerinin yapısını ve işlevini iyileştirmek erkek infertilitesini tedavi etmek için yeni bir yön olabilir.

Epimedium, ilk olarak "Shennong Bencao Jing "de kaydedilen besleyici özelliklere sahip geleneksel bir Çin şifalı bitkisidir. Böbrek yangını güçlendirici, kasları ve kemikleri güçlendirici, rüzgarı ve rutubeti giderici etkilere sahiptir. Modern farmakolojik araştırmalar Epimedium'un yaşlanmayı geciktirmede ve erkek üreme fonksiyonunu geliştirmede önemli etkileri olduğunu göstermiştir. Ana aktif bileşeni icariin'dir (ICA). Çalışmalar, ICA'nın sıçanlarda birincil Sertoli hücrelerinin çoğalmasını teşvik edebileceğini ve erkek Sertoli hücrelerinin işlevini artırabileceğini bulmuştur. Araştırmalar, ICA'nın destek hücrelerinde folikül uyarıcı hormon reseptörlerinin ve sıkı bağlantı proteini Claudin-11'in mRNA ekspresyon seviyelerini artırarak sıçanların üreme işlevini geliştirebileceğini ve böylece testis dokusunun antioksidan stres direncini artırabileceğini göstermiştir. Vücudun hücresel savunma sisteminin ana düzenleyicisi olan Nükleer faktör eritroid benzeri 2 (Nrf2), antioksidan yanıt elementlerinin (ARE) promotör düzenleyici bölgesindeki arttırıcı dizilere bağlanarak antioksidan proteinleri ve oksidatif stres yanıt proteinlerini kodlayan bir dizi genin ekspresyonunu düzenler, çeşitli stres koşullarına ve zararlı saldırılara karşı ince ayar tepkilerini koordine eder ve hücresel mikro çevre homeostazını sağlar. Araştırmalar, Epimedium'un Nrf2'yi aktive ederek oksidatif stres kaynaklı karaciğer hasarını hafifletebileceğini bulmuştur. Önceki araştırmalarımız, ICA'nın Nrf2'yi yukarı doğru düzenleyerek doğal olarak yaşlanan sıçanların testis germ hücrelerindeki DNA hasarını hafifletebileceğini bulmuştur. ICA, D-Gal tarafından indüklenen fare testis destek hücre hattı TM4'te sıkı bağlantı ile ilgili proteinler Occludin ve Claudin-1'in protein ekspresyonunu artırabilir. Bununla birlikte, ICA'nın Nrf2 sinyal yolu aracılığıyla D-Gal kaynaklı 15P-1 hücre hasarını iyileştirip iyileştiremeyeceği konusunda şu anda bir araştırma raporu bulunmamaktadır. Önceki çalışmalar D-Gal'in fare testis destek hücre hattı TM4 hücrelerinde sıkı bağlantı hasarına neden olabileceğini göstermiştir. Bu nedenle, bu deneyde ICA'nın Nrf2 sinyal yolundan Sertoli hücre hasarı üzerindeki koruyucu etkisini ve mekanizmasını araştırmak için bir hasar modeli olarak D-galaktoz (D-Gal) ile indüklenmiş 15P-1 hücreleri kullanılmıştır.

Son yıllarda, infertilite DSÖ tarafından bir halk sağlığı sorunu olarak kabul edilmiştir. Genel popülasyonda infertilite görülme oranı yıldan yıla artmakta ve dünyada doğurganlık çağındaki çiftlerin yaklaşık 15%'sini etkilemektedir. Araştırmalar, Amerika Birleşik Devletleri ve diğer Batı ülkelerinde sperm sayısının yılda 1,5% azaldığını göstermektedir ve dünya çapında yaklaşık 70 milyon çiftin kısırlık veya sterilite kurbanı olduğu tahmin edilmektedir. DSÖ tarafından yürütülen geniş çaplı bir epidemiyolojik araştırma, çiftlerin kısırlığının yaklaşık yarısının erkek faktörlerinden kaynaklandığını ve mekanizmanın henüz tam olarak anlaşılamadığını ortaya koymuştur.

Araştırmalar, D-Gal'in fare destek hücre hattı TM4 hücrelerinin sayısını ve işlevini azaltabileceğini bulmuştur. Bu nedenle, ICA'nın 15P-1 hücre hasarını hafifletip hafifletemeyeceğini değerlendirmek için D-Gal modelini seçtik. ECV-304 endotel hücreleri üzerinde 35, 70 ve 140 μ M ICA ile muameleden sonra hücre inhibisyon oranının 1.2% olduğu ve önemli bir sitotoksisite olmadığı yönünde literatür raporları bulunmaktadır. Bu deneyin MTT sonuçları, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, 15P-1 hücrelerini tedavi etmek için ICA tek başına kullanıldığında, IC50'nin 40 μ M konsantrasyonda 50%'den daha büyük olduğunu ve ICA'nın önemli bir sitotoksisiteye sahip olmadığını göstermiştir. Ön araştırmamız, ICA'nın D-Gal ile muamele edilen TM4 hücre hasarı üzerinde koruyucu bir etkiye sahip olduğunu ve 0,5 ve 1 μ M konsantrasyonlarda önemli bir proliferatif etkiye sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bu deneyin MTT sonuçları ayrıca, D-Gal tedavi grubuyla karşılaştırıldığında, ICA'nın 0,125-1 μ M'de konsantrasyona bağlı bir şekilde hücre hayatta kalma oranını artırdığını ve 0,5 ve 1 μ M konsantrasyonlarda hücre proliferasyonu üzerinde önemli bir teşvik edici etkiye sahip olduğunu göstermiştir.ICA'nın teşvik edici etkisi, konsantrasyon 1 μM'den büyük olduğunda zayıflamıştır; bunun nedeni, bu deneyde 15P-1 hücreleri üzerinde D-Gal'ın daha uzun stimülasyon süresi, daha ciddi hücre hasarı ve hasarlı hücrelerin ilaç stimülasyonuna karşı büyük ölçüde artan duyarlılığı olabilir, bu nedenle düşük konsantrasyonda teşvik ve yüksek konsantrasyonda inhibisyon fenomeni sergiler. Testiküler Sertoli Hücreleri, testislerin seminifer tübüllerinde bulunan ve spermatojenik hücrelere doğrudan bağlı olan somatik hücrelerdir. Spermatogonial kök hücrelerin çoğalmasını ve farklılaşmasını düzenlerler ve GDNF, BMP4 ve SCF gibi çeşitli sitokinleri salgılayarak sperm oluşumunu teşvik ederler. GDNF, dönüştürücü büyüme faktörü beta süper ailesinin bir üyesidir ve spermatogonyal kök hücrelerin proliferasyonunu düzenlemede önemli bir faktördür. Erkek üreme hücrelerinin gelişiminde ve erken testis gelişiminde çok önemli bir rol oynar. BMP4 ve SCF, spermatogonial kök hücrelerin farklılaşmasını teşvik eden önemli faktörlerdir. Araştırma grubumuz tarafından yapılan önceki araştırmalar, Epimedium'un toplam flavonoidlerinin, doğal olarak yaşlanan sıçan testislerinde Sertoli hücreleri tarafından salgılanan GDNF, BMP4 ve SCF'nin mRNA ve protein seviyelerini yukarı doğru düzenleyebildiğini ve Sertoli hücre salgılama işlevini geliştirdiğini göstermiştir. Sonuçlar, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, Sertoli hücresi salgılanan faktörlerin mRNA ve protein ekspresyon seviyelerinin D-Gal tedavisinden sonra önemli ölçüde azaldığını, Sertoli hücresi salgılanan faktörlerin mRNA ve protein ekspresyon seviyelerinin ICA tedavisinden sonra 15P-1'de önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini göstermiştir. ICA, 15P-1 testiküler Sertoli hücrelerinin salgılama fonksiyonunu iyileştirebilir.

Destek hücreleri arasındaki sıkı bağlantılar, kan testis bariyerinin en önemli bileşenidir ve esas olarak Occludin, Claudin ve adezyon proteinlerinin üç transmembran protein ailesinin yanı sıra blokaj bağlantısının sitoplazmik protein ailesini içerir. Hücreler arasındaki sıkı bağlantılar sadece üreme hücrelerini bağışıklık sistemi istilasından korumakla ve spermatogenez için iyi bir fizyolojik ortam sağlamakla kalmaz, aynı zamanda ince öncesi ve ince sonrası spermatositlerin daha fazla gelişme için düzenli olarak kan testis bariyerinden geçmesine izin verir. Araştırmalar, Occludin ve Claudin'in en erken tanımlanan sıkı bağlantı membran proteinleri olduğunu ve sıkı bağlantı kabiliyeti ve epitelyal bariyer işlevine esas olarak Claudin'in aracılık ettiğini bulmuştur. Başka bir çalışma, sıçan testislerine sentetik Occludin peptidinin enjekte edilmesinin 27 gün sonra çoğu spermatogonyayı geri dönüşümlü olarak ortadan kaldırabildiğini, Occludin'in in vitro olarak devre dışı bırakılmasının da destek hücrelerinin sıkı bağlantı işlevinde bir azalmaya yol açabileceğini göstermiştir. Bu deneyin sonuçları, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, 15P-1 hücrelerindeki sıkı bağlantı proteininin ekspresyonunun D-Gal tedavisinden sonra azaldığını, 15P-1 destek hücrelerindeki sıkı bağlantı proteininin ekspresyonunun ise ICA tedavisinden sonra önemli ölçüde arttığını göstermiştir. ICA, 15P-1 destek hücrelerindeki sıkı bağlantı proteini hasarı üzerinde koruyucu bir etkiye sahiptir.

Vücut normal bir durumdayken, Kelch like ECH associated protein-1 (Keap1) Nrf2'yi toplar ve sitoplazmada ubikitin proteaz tarafından parçalanan bir kompleks oluşturur; Oksidatif stres meydana geldiğinde, Nrf2 Keap1'den ayrılır ve Nrf2, ARE'ye bağlanmak için sitoplazmadan çekirdeğe aktarılır, HO-1 ve NQO1 gibi aşağı akış koruyucu genlerin transkripsiyonunu aktive eder, böylece vücuda çeşitli uyaranların neden olduğu oksidatif stres hasarına direnir. Önceki araştırmalarımız, ICA'nın doğal olarak yaşlanan sıçanlarda testis DNA hasarını hafifletebileceğini ve Nrf2/HO-1 sinyal yolunu aktive ederek yaşlanmanın neden olduğu üreme fonksiyonundaki azalmayı iyileştirebileceğini göstermiştir. Bu, ICA'nın spermatogenik disfonksiyonu iyileştirmesinin Nrf2 sinyal yolağı ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Önceki çalışmalar ICA'nın D-Gal ile indüklenen testis destek hücre hattı TM4 hücre hasarını iyileştirebileceğini göstermiştir. Bu nedenle, bu çalışmada Nrf2 yolağı proteinlerini tespit etmek için Western blot kullanılmıştır. Sonuçlar, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, 15P-1 hücrelerinde önemli Nrf2 yolu proteinleri Nrf2, HO-1 ve NQO-1'in ekspresyon seviyelerinin D-Gal uyarımından sonra önemli ölçüde aşağı regüle edildiğini, ICA uygulamasından sonra ise önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Daha sonra, immünofloresan teknolojisini kullanarak Nrf2'nin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu tespit ettik. Normal kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, D-Gal tedavi grubundaki 15P-1 hücrelerinin çekirdeğindeki Nrf2'nin floresan ekspresyonu zayıflamış, ancak ICA tedavisinden sonra iyileşmiştir. Yukarıdaki sonuçlar, 15P-1 hücrelerinin fonksiyonel ve yapısal hasarının Nrf2 sinyal yolunun aşağı regülasyonu ile ilişkili olduğunu ve bunun da hücresel antioksidan kapasitede azalmaya yol açtığını göstermektedir. ICA, antioksidan kapasitelerini artırarak 15P-1 hücrelerinin hasarını iyileştirebilir.

Özetle, ICA, Nrf2 sinyal yolunu aktive ederek 15P-1 hücrelerinde salgı ile ilgili proteinler GDNF, BMP4, SCF'nin yanı sıra sıkı bağlantı ile ilgili proteinler Occludin ve Claudin-1'in ekspresyon seviyelerini yükseltebilir ve böylece 15P-1 hücrelerinde D-Gal kaynaklı hasarı iyileştirebilir. Bu deney, Çin bitkisel ilacı Epimedium'un üreme sistemindeki uygulama değerini daha iyi keşfetmek ve erkek infertilitesinin klinik tedavisi için yeni yönler sağlamak amacıyla ICA'nın germ hücreleri üzerindeki koruyucu etkisi ve mekanizması üzerine sonraki araştırmalarımız için teorik bir temel oluşturmuştur.