Scutellaria baicalensis'te PI3K/Akt/FoxO3a Yolağını Düzenleyen ve Yaşlanmayı Geciktiren Toplam Kafeoilkinik Asit Mekanizması Üzerine Çalışma
Yaşlanma, yaşa bağlı kademeli bir fizyolojik gerilemedir ve hayatta kalma yeteneğinin kaybına ve kırılganlığın artmasına neden olur. Yaşlanma çevresel ve genetik faktörlerden etkilenir ve on iki ana özelliğe sahiptir: genomik istikrarsızlık, epigenetik değişiklikler, telomer tükenmesi, beslenme algısı bozuklukları, protein homeostaz dengesizlikleri, mitokondriyal disfonksiyon, hücresel yaşlanma, anormal hücreler arası iletişim, kök hücre tükenmesi, makrootofaji inaktivasyonu, kronik inflamasyon ve bağırsak mikrobiyota disbiyozu. Bu özellikler arasında, insülin ve insülin benzeri büyüme faktörü-1'in (IGF-1) insülin reseptörlerine bağlanması yoluyla aşağı akış sinyal yollarını düzenleyerek yaşam süresini etkileyen 'beslenme düzensizliği' moleküler düzeyde doğrulanmış ilk özelliktir. İnsülin/IGF-1, 4,5-difosfat fosfatidilinositolden (PIP2) 3,4,5-trifosfat fosfatidilinositol (PIP3) üretimini katalize eden fosfatidilinositol 3-kinazı (PI3K) aktive etmek için insülin reseptörlerine bağlanır. Ardından, protein kinaz B (Akt/protein kinaz B, Akt/PKB) plazma membranına alınır ve Akt'deki treonin sırasıyla PIP3 bağımlı kinaz-1 ve -2 (PDK-1 ve PDK-2) aracılığıyla ifade edilir. Fosforilasyon, serinin 308 (Thr308) ve 473 (Ser473) pozisyonlarında gerçekleşerek fosforile Akt (t phosphop Akt, p-Akt) oluşturur ve Akt'yi aktive eder. Forkhead box class O3a (FOXO3a), forkhead box transkripsiyon faktörü O alt ailesinin dört üyesinden biridir. Aktive Akt, FoxO3a'nın treonin 32 bölgesini (Thr32) ve serin 253 bölgesini (Ser253) fosforile ederek fosforile FOXO3'ü (bir fosfop-FOXO3a, p-FOXO3a) oluşturur, bu da FoxO3a'nın 14-3-3 proteinine bağlanmasını teşvik eder, böylece FoxO3a'nın çekirdeğe girmesini ve transkripsiyonel aktiviteyi kaybetmesini önler. FoxO3a, otofajiyi teşvik ederek, oksidatif direnci artırarak ve kök hücre pluripotensini koruyarak uzun ömürlülüğü teşvik etmede rol oynayabilen, yaşlanmayı düzenleyen önemli bir transkripsiyon faktörüdür. Oksidatif direnç açısından, FoxO3a transkripsiyonel aktivasyonu süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH Px) ve katalaz (CAT) gibi genlerin ekspresyonunu artırır, reaktif oksijen türlerini (ROS) temizler ve lipid peroksidasyon ürünü malondialdehit (MDA) seviyesini azaltır, böylece vücut yaşlanmasını geciktirir ve yaşam süresini uzatır. Omurgasız ve omurgalı modellerinde yapılan çalışmalar, insülin/IGF-1 seviyelerinin azaltılmasının ve insülin reseptörleri, PI3K ve Akt'nin mutasyona uğratılmasının FoxO3a nükleer translokasyonunu teşvik edebileceğini, transkripsiyonel aktivitesini artırabileceğini ve yaşlanmayı geciktirebileceğini göstermiştir.
Erigeron breviscapus (Vant.) Hand- Mazz.)， Dengzhan Hua olarak da bilinir, ilk olarak "Dian Nan Ben Cao" da kaydedilmiştir, kan dolaşımını teşvik etme, meridyenlerin tıkanıklığını açma, ağrıyı hafifletme, rüzgarı giderme ve soğuğu giderme etkilerine sahiptir. Esas olarak inme hemiplejisi, göğüs ağrısı, romatizma ağrısı, baş ağrısı ve diş ağrısı tedavisinde kullanılır. Flavonoidler ve kafeoilkinik asit (CQA) Scutellaria baicalensis'in ana aktif bileşenleridir. Ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme kullanılarak yapılan önceki çalışmalar, flavonoidlerin ve CQA bileşiklerinin Scutellaria baicalensis'in yaşlanma karşıtı özelliklerinde potansiyel aktif bileşenler olduğunu ve dört temel hedefi düzenleyerek yaşlanma karşıtı etkiler gösterebileceğini bulmuştur: p53, AKT, HDAC1 ve SIRT1. Moleküler kenetlenmede, tek CQA bileşenleri 4-CQA, 5-CQA, klorojenik asit ve dikafeoilkinik asit (DCQA) bileşenleri 4,5-DCQA, 3,4-DCQA, 3,5-DCQA, 1,3-DCQA ve 1,5-DCQA içeren kafeoil bileşikleri, AKT ile inhibitör ligandlarından daha yüksek kenetlenme skorlarına sahiptir. Yaşam süresi deneyi, bu bileşenlerin hepsinin nematodların yaşam süresini uzatma etkisine sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bunlar arasında, mutant suşlar ve transgenik nematodlar aracılığıyla 3,5-DCQA'nın nematodlarda PI3K ve AKT homologları AGE-1 ve AKT-1'in aktivitesini inhibe ettiği, FoxO3a homologu DAF-16'nın çekirdeğe girişini teşvik ettiği ve böylece uzun ömürlülüğü teşvik edici bir etki gösterdiği doğrulanmıştır. Yukarıdaki bulgular, Scutellaria baicalensis'teki CQA bileşenlerinin AKT aktivitesini inhibe ederek ve PI3K/Akt/FoxO3a yolunu düzenleyerek yaşlanmayı geciktirebileceğini göstermektedir. Bu çalışmanın amacı, önceki araştırmalara dayanarak Erigeron breviscapus'tan (EBCQA) elde edilen toplam kafeoilkinik asidin yaşlanma karşıtı etkisini gözlemlemek ve PI3K/Akt/FoxO3a yolağına dayalı olarak EBCQA'nın yaşlanma karşıtı mekanizmasını araştırmaktır.

Yaşlanma yaşamın doğal bir sürecidir ve kaçınılmaz olmasına rağmen beslenme düzenlemesi, genetik manipülasyon, ilaç müdahalesi ve diğer yollarla geciktirilebilir. Daha da önemlisi, bu yaşlanma karşıtı müdahaleler yalnızca yaşam süresini uzatmakla kalmaz, aynı zamanda vücudun genel sağlığını da önemli ölçüde iyileştirir. Önceki çalışmalarda, EBCQA'nın potansiyel yaşlanma karşıtı etkilere sahip olduğunu ve AKT aktivitesini düzenlemekle ilişkili olabileceğini bulmuştuk. Bu çalışmada, EBCQA'nın nematodların ömrünü uzatma, oksidatif ve ısı direncini artırma ve hareketliliği iyileştirme etkilerine sahip olduğunu doğruladık. Nematodların mutant suşları aracılığıyla, EBCQA'nın yaşlanma karşıtı etkisinin PI3K/Akt/FoxO3a yolağının düzenlenmesi, antioksidan enzim aktivitesinin artırılması ve MDA seviyelerinin azaltılması ile ilişkili olduğunu doğruladık; D-galaktoz ile yaşlandırılan sıçanlarda, EBCQA öğrenme ve hafıza yeteneklerini, timus ve dalak katsayılarını artırır, PI3K ve Akt aktivasyonunun yanı sıra FoxO3a fosforilasyonunu inhibe eder, antioksidan enzim aktivitesini artırır ve MDA seviyelerini azaltır.
CQA sınıfı bileşenler Scutellaria baicalensis'teki fenolik aktif bileşenlerin önemli bir sınıfıdır ve aynı zamanda birçok gıdada (mor tatlı patates, yeşil kahve gibi) ve şifalı bitkilerde de bulunur. CQA bileşikleri nöroprotektif, kardiyovasküler koruyucu, antioksidan, anti-inflamatuar, anti-diyabet ve diğer etkilere sahiptir. Yaşlanma karşıtı olarak, CQA bileşenleri bakımından zengin yeşil kahve ekstresi ve hanımeli ekstresi nematodların ömrünü uzatmıştır, ancak yaşlanma karşıtı mekanizmalarının PI3K/Akt/FoxO3a yolunu içerip içermediği hala belirsizdir; Memelilerde CQA bileşenlerinin yaşlanma karşıtı etkileri nadiren bildirilmiştir. CQA bileşenlerinin nematod ömrünü uzatma yeteneğine sahip olduğuna dair önceki raporlarla tutarlı olarak, EBCQA'nın nematod ömrünü maksimum 17.7% uzama oranıyla uzattığını ve oksidatif direnci, ısı direncini ve hareketliliği artırdığını bulduk. D-galaktoz ile indüklenen yaşlanan sıçan modelinin doğal yaşlanmayı etkili bir şekilde simüle ettiği kanıtlanmıştır ve bu nedenle yaşlanma mekanizmalarını incelemek ve yaşlanmayı geciktiren ilaçları taramak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Azalan öğrenme ve hafıza yetenekleri yaşlanmayla ilişkili yaygın fizyolojik olaylardır ve bazıları Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklara dönüşebilir. Yaş arttıkça veya hastalıklar ortaya çıktıkça, vücudun bağışıklık kapasitesi genellikle yavaş yavaş azalır. Timus ve dalak önemli bağışıklık organlarıdır ve organ endeksleri bir dereceye kadar vücudun bağışıklık kapasitesinin boyutunu yansıtabilir. Bu nedenle, öğrenme ve hafıza yeteneğinin yanı sıra timus/dalak organ indeksi, yaşlanmayı ve yaşlanmayı geciktirmeyi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan göstergelerdir. D-galaktoz ile yaşlandırılan sıçanlarda öğrenme ve hafıza yeteneklerinin yanı sıra timus ve dalak katsayılarında da azalma görülmüştür. EBCQA uygulaması öğrenme ve hafıza yeteneklerini etkili bir şekilde geliştirmiş, timus ve dalak katsayılarını artırmıştır. Bu sonuçlar, EBCQA'nın hem omurgasız nematodlarda hem de omurgalı D-galaktoz kaynaklı yaşlanan sıçanlarda yaşlanma karşıtı bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.
PI3K/Akt/FoxO3a yolu, insülin, IGF-1 ve diğer faktörler tarafından düzenlenen evrimsel olarak korunmuş bir sinyal yoludur. Yaşlanma düzenlemesinde PI3K ve Akt yaşlanma yanlısı bir rol oynarken, FOXO3a yaşlanma karşıtı bir rol oynar. Nematodlarda AGE-1, AKT-1 ve DAF-16 sırasıyla memeli PI3K, Akt ve FoxO3a'nın homologlarıdır. AGE-1 mutasyonlarına sahip nematodların ortalama yaşam süresi 40% ila 65% arasında uzar, AKT-1 mutasyonlarına sahip olanların da yaşam süreleri önemli ölçüde uzar ve DAF-16 mutasyonları yaşam sürelerini önemli ölçüde kısaltır. Memelilerde, AKT-1'in aşırı ekspresyonu hücresel yaşlanmaya neden olur. AKT-1 mutasyonlu farelerde (Akt1+/-) erkeklerin yaşam süresinde 8%, dişilerin yaşam süresinde ise 15% artış görülmektedir. Uzun ömürlü popülasyonlar üzerinde yapılan araştırmalar, IGF-1 reseptörlerinin, insülin reseptörlerinin veya bunların aşağı akış faktörlerinin (PI3K, AKT gibi) işlev kaybına yol açan genetik polimorfizmlerin/mutasyonların insan ömrünün uzamasıyla ilişkili olduğunu da ortaya koymuştur. Japon Amerikalılar, Han Çinlileri, Kaliforniyalılar, New Englandlılar, Aşkenaz Yahudileri, Danimarkalılar, Almanlar ve İtalyanlar arasında uzun ömürlü popülasyonların incelenmesi, FOXO3a'nın rs2764264, rs2802292 vb. genetik polimorfizmlerinin uzun ömür ve sağlıklı yaşlanma ile ilişkili olduğunu göstermektedir. PI3K/Akt/FoxO3a yolağının düzenlenmesinde Akt, Thr308 ve Ser473'ün fosforilasyonu üzerine aktive olurken, FoxO3a Thr32 ve Ser253'ün fosforilasyonu üzerine inhibe olur. Bu çalışmada, EBCQA vahşi tip nematod N2'nin ömrünü uzatmış ve DAF-16 nükleer translokasyonunu teşvik etmiştir, ancak AGE-1, AKT-1 ve DAF-16 mutantlarının ömrü üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır, bu da EBCQA'nın ömrünü uzatmadaki rolünün PI3K/Akt/FoxO3a yolunun düzenlenmesine bağlı olduğunu göstermektedir. D-galaktoz ile tedavi edilen sıçanlar PI3K, Akt, p-Akt ve p-FOXO3a ekspresyonunun yukarı regülasyonunu gösterirken, FOXO3a ekspresyonu aşağı regüle edilmiştir. Bu durum, D-galaktoz ile indüklenen yaşlanan sıçanlar ve doğal olarak yaşlanan küçük/büyük sıçanlardaki değişikliklere ilişkin önceki raporlarla tutarlıdır. Protein ekspresyonundaki bu değişiklikler, öğrenme ve hafıza yeteneklerinin azalmasının yanı sıra timus ve dalak katsayılarının azalmasına ve dolayısıyla yaşlanmaya neden olabilir. EBCQA uygulamasından sonra, bu değişiklikler engellenmiştir ve bu da yaşlanmayı geciktirici bir etkiye sahip olabilir.
1956 yılında İngiliz bilim adamı Harmna, biyomoleküllere serbest radikal saldırılarının neden olduğu hücresel işlev bozukluğunun vücuttaki yaşlanmanın temel nedenlerinden biri olduğuna inanarak ilk kez serbest radikal yaşlanması teorisini öne sürmüştür. Bu çalışmada EBCQA, paraquat ile muamele edilen nematodlarda ve D-galaktoz ile muamele edilen sıçanlarda SOD, GSH Px ve CAT aktivitelerini artırırken MDA seviyelerini düşürmüştür. Bu antioksidan enzimlerin aktivitesindeki artış, ROS ve oksidatif hasarda azalmaya yol açarak yaşlanmayı geciktirmeye yardımcı olabilir. PI3K/Akt/FoxO3a yolağının yaşam süresini etkilediği aşağı akış mekanizmalarından biri oksidatif direncin düzenlenmesidir. Nematodlarda, daf-2 (e1368) ve age-1 (hx546) gibi bazı uzun ömürlü mutant suşlar, DAF-16'ya bağlı olan antioksidan enzimler SOD, GSH Px ve CAT'nin gelişmiş aktivitelerini sergiler. DAF-16 mutasyonundan sonra, bu mutant suşların antioksidan enzim aktivitesi, vahşi tip nematod N2'ninkine neredeyse benzerdir. Memelilerde FoxO3a, SOD, GSH Px, CAT gibi antioksidan enzimlerin ekspresyonunu düzenler ve FoxO3a'nın aktivitesini inhibe ederek hücrelerde ROS birikimine yol açar, aterosklerozu hızlandırır ve kanser riskini artırır. EBCQA, nematod DAF-16'nın nükleer girişini teşvik eder ve sıçan FoxO3a'nın fosforilasyonunu inhibe eder, bu da EBCQA'nın FoxO3a transkripsiyonel aktivitesini ve antioksidan enzim aktivitesini artırarak yaşlanma karşıtı bir rol oynayabileceğini gösterir.
Özet olarak, EBCQA nematodların ömrünü etkili bir şekilde uzatabilir ve sıçanlarda D-galaktoz kaynaklı yaşlanmayı antagonize edebilir. Etki mekanizması PI3K ve Akt aktivasyonunu inhibe ederek, FOXO3a fosforilasyonunu azaltarak, FOXO3a nükleer ve transkripsiyonel aktivitesini teşvik ederek, antioksidan enzim aktivitesini artırarak, oksidatif stresi inhibe ederek ve böylece yaşlanmayı geciktirerek olabilir.