Kitosan oligosakkaritlerinin dekstran sülfat ile indüklenmiş kolitli fareler üzerindeki koruyucu etkisi
İnflamatuar bağırsak hastalığı (İBH) ülseratif kolit (ÜK) ve Crohn hastalığını (CD) içerir. Ülseratif kolit 1875 yılında Wilk ve Moxon tarafından keşfedilmiş, 1903 yılında Boas ve Wilk tarafından tanımlanmış ve 1905 yılında DSÖ tarafından resmi olarak özel bir klinik durum olarak belirlenmiştir. Ülseratif kolit, esas olarak kalın bağırsağın sigmoid kolon ve rektumunda yerleşen spesifik olmayan bir kolittir. Lezyonlar mukoza ve submukozada sürekli olarak dağılır ve yavaşça tekrarlar. Çeşitli ekstraintestinal semptomların eşlik ettiği, çoğunlukla karın ağrısı, ishal ve irinli ve kanlı yapışkan dışkı ile kendini gösteren akut başlangıçlı birkaç vaka da vardır. Ülseratif kolitin kesin etiyolojisi ve patogenezi hala belirsizdir ve genellikle enfeksiyon, bağışıklık sistemi bozuklukları, genetik duyarlılık, çevre, ruhsal durum ve disbiyoz gibi çeşitli faktörlerle ilişkili olduğuna inanılmaktadır. Batı ülkelerinde çok yaygındır, her 105 kişide 10-20 kişi bu hastalıktan muzdariptir ve Kuzey Amerika ve Batı Avrupa'da görülme oranı daha yüksektir. Son yıllarda Çin'de de ÜK görülme sıklığı artmaktadır. Şu anda, kolit tedavisi için 5-aminosalisilik asit (sulfasalazin) ve immünosupresanlar gibi semptomatik ilaçlar mevcuttur, ancak bunların bazı yan etkileri vardır ve bu da güvenli ilaç arayışını bir araştırma noktası haline getirmektedir.
Kitooligosakkaritler (COS), kitosanın (CS) hidrolizi ile üretilir, polimerizasyon derecesi 2-20 ve ortalama moleküler ağırlığı 3900 Da'dan azdır. Moleküler ağırlığı küçüktür, suda kolayca çözünür ve biyolojik organizmalar tarafından doğrudan absorbe edilebilir. Yağ azaltma, kan şekerini düşürme, bakterileri inhibe etme, kanserle savaşma ve anti-inflamatuar gibi biyolojik aktivitelere sahiptir ve toksik yan etkisi yoktur. Tıp, kozmetik, gıda ve tarım gibi çeşitli alanlarda yaygın olarak kullanılabilir. Kitosan, selülozdan sonra dünyada en bol bulunan ikinci polimer olan kitinin deasetilasyonu ile elde edilebilir (genellikle kabuklu deniz hayvanlarının kabuklarında, böcek epidermisinde ve mantar hücre duvarlarında bulunur). Şu anda, kitosan oligosakkaritlerinin kolit üzerindeki etkisi üzerine bazı çalışmalar yapılmıştır, örneğin Yang ve arkadaşlarının kitosan oligosakkaritlerinin AMPK ve NF - κ B yoluyla kolit üzerinde koruyucu etkiler sağlayabileceğini keşfetmesi gibi. Bununla birlikte, uygulama konsantrasyonu önemli ölçüde daha yüksektir (genellikle 500 mg/kg, yaklaşık 3,6 g'lık bir insan dozuna eşdeğerdir) ve 0,5 g/gün'lük ulusal tavsiye edilen alım dozunun çok üzerindedir (bkz. Kitosan Oligosakkaritleri İçeren Altı Yeni Gıda Bileşeninin Onaylanmasına İlişkin Duyuru (2014 No. 6), 70 mg/kg'lık bir fare dozuna eşdeğerdir). Yousef, 20 mg/kg dozundaki kitosan oligosakkaritlerinin de asetik asit infüzyon kolit modeli ve bağırsak epitel hücre deneylerini kullanarak kolit üzerinde koruyucu bir etkiye sahip olabileceğini bulmuştur. Bu nedenle, bu makalede kitosan oligosakkaritlerin farklı dozlarda (70 ve 140 mg/kg) kolit üzerindeki müdahalesini doğrulamak, kitosan oligosakkaritlerin farelerde kolit semptomlarını ve fizyolojik durumu düzenlemedeki rolünü araştırmak ve kitosan oligosakkaritlerin DSS ile indüklenen kolit fareleri üzerindeki koruyucu etkisi hakkında daha fazla araştırma için veri desteği sağlamak amacıyla 3% DSS içme suyu ile indüklenen kolit fare modeli kullanılmıştır. Bu deneyde, 50 erkek C57BL/6 fare rastgele 5 gruba ayrılmıştır: model oluşturmak için 7 gün boyunca 3% sodyum dekstran sülfat (DSS) içeren su içirilerek boş grup, model grup, pozitif grup (SASP, 50 mg/kg) ve düşük ve yüksek doz kitosan grupları (70 ve 140 mg/kg). Kitooligosakkaritlerin etkisini ağırlık değişiklikleri, hastalık aktivite indeksi, patolojik skor ve miyeloperoksidaz aktivitesi aracılığıyla değerlendirmek. ELISA ile kolitteki enflamatuar faktörlerin seviyelerini tespit edin.

DSS kolit modeli, 1990 yılında kurulan uluslararası kabul görmüş ve yaygın olarak kullanılan deneysel bir UC hayvan modelidir. Patolojik değişiklikleri arasında ülser oluşumu, kript apsesi, küçük damar iltihabı, azalmış goblet hücreleri ve insan kolitinin klinik semptomlarına benzer çeşitli iltihap hücrelerinin infiltrasyonu yer almaktadır. Ülke tarafından önerilen insan kitosan dozu 0,5 g/kişidir ve bu da 70 mg/kg'lık bir fare dozuna dönüştürülür. Bu nedenle, bu modeli kullanarak, DSS ile indüklenen kolit üzerindeki müdahale etkilerini araştırmak için 70 mg/kg ve 140 mg/kg olmak üzere iki kitosan dozu seçtik. Kore literatüründe oligosakkaritler üzerinde akut toksisite deneyleri yapılmış ve farelerde oligosakkaritlerin LD50'sinin 5.0 g/kg'ı aştığı bulunmuştur. Zhao ve arkadaşlarının kitosan fonksiyonel gıdalarının güvenlik değerlendirmesi, farelere (1,25 g/kg/gün) ve sıçanlara (1,47 g/kg/gün) (klinik olarak önerilen dozun yaklaşık 312-368 katı) uygulamadan sonraki 10 gün içinde hiçbir akut toksik reaksiyon gözlenmediğini göstermiştir. Bu deneyde, farelerin 7 gün boyunca 3% DSS'yi serbestçe içmelerine izin verilerek bir ülseratif kolit modeli oluşturulmuştur. Deneyin 6. gününde, model grup farelerde kilo kaybı, iştahsızlık, düzensiz tüyler, ishal, kanlı yapışkan dışkı ve hatta rektal kanama gibi tipik fizyolojik kolit semptomları gözlenmiştir. Diseksiyonun sekizinci gününde, model grup farelerin kolonunun kısaldığı ve kolon dokusunun tıkalı ve ödemli olduğu tespit edilmiştir. HE boyamasında kolon mukozasında ödem, eksik epitel hücreleri, kript glandüler yapının kaybolması ve şiddetli inflamatuar infiltrasyon görüldü. Yukarıdaki semptomlar düşük doz (70 mg/kg) ve yüksek doz (140 mg/kg) kitosan müdahalesi ile tedavi edilen farelerde iyileşmiştir. Yousef ve arkadaşlarının sonuçlarıyla tutarlı olarak, kitosan oligosakkaritlerinin bağırsak epitel hücrelerinin apoptozunu azaltabileceğine, enflamasyonu engelleyebileceğine ve bağırsak epitel bariyerinin yapısal ve işlevsel bütünlüğünü koruyabileceğine dikkat çekmiştir. Bazı çalışmalar, enflamatuar bağırsak hastalığının bağırsak epitel bariyerindeki kusurlardan ve mukozal immün yanıtın düzensizliğinden kaynaklandığını öne sürmektedir. Kitosan oligosakkaritler bağırsak epitel hücrelerini koruyabilir, bu da enteritte önemli koruyucu rollerine işaret eder. Bu deneyde, kitosan 70 mg/kg doz grubu kolon kısalmasını iyileştirme, kolonik mukozal ödemi hafifletme ve goblet hücreleri ile kript yapılarını korumada model gruba kıyasla anlamlı farklılıklar göstermiştir. Bununla birlikte, 140 mg/kg doz grubu model gruba kıyasla kolon kısalmasını iyileştirmede anlamlı bir fark göstermezken, sadece patolojik doku skorlarını iyileştirmede anlamlı bir fark göstermiştir. Bu da düşük doz kitosan grubunun DSS ile indüklenmiş kolit fareleri üzerinde daha iyi bir koruyucu etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Sonuçlar, 70 mg/kg kitosan dozunun farelerde kolon kısalmasını hafifletmede ve kolon yapısını korumada belirli bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir ki bu da kitosanın ulusal olarak önerilen dozda geliştirilmesi ve uygulanması için yararlıdır.

Günümüzde, İBH için ana tedavi yönleri oksidatif stres ve inflamasyondur. Oksidatif stresin İBH'nin patojenik temeli olduğuna ve aşırı oksijensiz radikallerin ülseratif inflamatuar doku hasarı ve kolit oluşumunda önemli bir faktör olduğuna inanılmaktadır. MDA üretimi ile aşırı NO, oksijensiz radikaller üreterek oksidatif hasara neden olur ve dokuda çok sayıda enflamatuar hücrenin infiltrasyonuna yol açar. Nötrofiller, UC'nin erken evrelerinde inflamasyon bölgesine en hızlı toplanan bağışıklık hücreleridir. İkili bir işlevi vardır. Bir yandan epitelyal kriptlerde ve bağırsak boşluklarında toplanır ve reaktif oksijen türleri (ROS) salgılayarak IL-1, IL-6, MPO vb. salgılar ve daha fazla doku hasarına neden olur. Öte yandan, anti-enflamatuar faktörler salgılayarak doku homeostazını aktif olarak korur ve mikrobiyal istilayı sınırlayabilir. Qiao ve arkadaşları, kitosan oligosakkaritlerinin LPS ile indüklenen sepsis fare modellerinde nötrofillerin infiltrasyonunu ve hasarlı organlarda lipid peroksidasyonunu azaltabileceğini bulmuştur. Dou ve arkadaşları, kitosan oligosakkaritlerinin tavşanlarda reaktif oksijen türlerinin üretimini, degranülasyonu ve aktive nötrofillerin yapışmasını inhibe edebildiğini ve böylece anti-enflamatuar etkiler gösterdiğini bulmuştur. Miyeloperoksidaz değeri (MPO), mukozal rüptür ve ülserasyona yol açabilen doku hasarı ve nötrofil (PMN) infiltrasyonunun bir belirtecidir ve İBH ile yakından ilişkilidir.

Deneyde, kolit model grubu farelerdeki MPO aktivitesi, boş gruba kıyasla önemli ölçüde artmıştır, bu da bağırsak dokusunda nötrofillerde önemli bir artış ve şiddetli infiltrasyon olduğunu göstermektedir. Kitosan oligosakkarit müdahalesinden sonra, kolon dokusundaki MPO aktivitesi azalmış, model gruptan önemli ölçüde farklı olmasa da, bağırsakta nötrofil agregasyonunu yavaşlatma ve daha fazla doku hasarını azaltma eğilimi olmuştur. Bu, Dou ve arkadaşlarının kitosan oligosakkaritlerinin nötrofil apoptozunu teşvik edebileceği ve glikojen peritonitli farelerde MPO salınımını azaltabileceği keşfi ile tutarlıdır. Bunun PLD ve PI3K'nın aktivasyonu ile ilişkili olabileceği ve nötrofil süperoksit ve diğer maddelerin üretimini indükleyebileceği tahmin edilmektedir.

UC, aralarında sitokinlerin de önemli bir rol oynadığı çok sayıda faktörün birlikte çalışmasının sonucudur. IL-6 düşük konsantrasyonlarda T hücre proliferasyonunu uyarabilir, B hücre proliferasyonunu aktive edebilir, antikor salgılayabilir ve yüksek konsantrasyonlarda vücudun enflamatuar yanıtına katılabilir. TNF-α， Tümör nekroz faktörü alfa olarak da bilinir, aktive makrofajlar II monositler tarafından üretilir ve apoptozu teşvik eder. IL-6 ve TNF - α, iki önemli enflamatuar sitokin olarak, vücuttaki patojenik uyaranlara yanıt veren en hızlı ve önemli enflamatuar faktörlerdir. Bağışıklık hastalıkları, enflamatuar yanıtlar ve tümör bağışıklığı gibi çeşitli patolojik süreçlerde yaygın olarak bulunurlar. ÜK hastalarının kolon mukozal dokusunda, IL-6 ve TNF - α ekspresyonu aktif fazda remisyon fazına göre çok daha yüksektir ve ayrıca bağırsak mukozasının inflamasyonu ve immün yanıtında önemli roller oynarlar ve İBH'ye aracılık eden anahtar sitokinler olarak kabul edilirler. Nükleer faktör kappa B (NF - κ B), inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu ile ilgili önemli bir transkripsiyon faktörüdür. Vücut uyarıldığında, I κ B aktive edilebilir ve parçalanabilir, sitoplazmada NF - κ B'yi aktive eder ve çekirdeğe girer, gen transkripsiyonunu indükler ve IL-1 β, IL-6, IL-12 ve TNF - α gibi çeşitli inflamatuar veya kemokinleri üretir, bunlar geri besleme amplifikasyonu yoluyla daha da şiddetlenir. Youself ve arkadaşları, kitooligosakkaritlerin NF - κ B yolunu inhibe ederek vücuttaki enflamatuar reaksiyonları hafiflettiğine inanmaktadır. Bu deneyde, ülseratif kolit farelerinin kolon dokusunda IL-6 ve TNF - α ekspresyonu önemli ölçüde artarken, düşük ve yüksek dozlarda kitosan oligosakkaritlerle müdahale, Yang ve Youself ve arkadaşlarının sonuçlarıyla tutarlı olarak ekspresyon seviyelerini önemli ölçüde azaltabilir. Bu da oligosakkaritlerin enflamatuar reaksiyonları hafifleterek kolit semptomlarını etkili bir şekilde iyileştirebileceğini göstermektedir.

İki doz kitosan oligosakkaritin deneysel sonuçları karşılaştırıldığında, her iki doz kitosan oligosakkaritin de DSS'nin neden olduğu kilo kaybını, kolon kısalmasını yavaşlattığı ve hastalık aktivite indeksini inhibe ettiği ve MPO aktivitesini artırdığı bulunmuştur. Histopatolojik değişiklikleri önemli ölçüde iyileştirmiş ve doku TNF - α ve IL-6 seviyelerini artırmıştır. Bunlar arasında, düşük doz grubu ve yüksek doz grubu kolon uzunluğu ve histopatolojik değişiklikleri hafifletmede daha iyi etkilere sahipti. Bu, düşük doz COS grubunun kolit semptomlarını hafifletmede daha iyi bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Yousef ve arkadaşları kolitli fareleri 1, 5, 10, 20, 50 ve 100 mg/kg dozlarında COS ile tedavi etmiş ve 10 ve 20 mg/kg COS'un en iyi etkiye sahip olduğunu bulmuştur. COS dozu ve etkisi arasındaki benzer çan şekilli ilişkiler, LPS ve TNF - α tarafından indüklenen T84 hücrelerinde de gözlenmiştir, bu da COS'un iki farklı sinyal yolunu uyarabileceğini, zıt etkiler üretebileceğini ve fonksiyonel antagonizmaya neden olabileceğini düşündürmektedir. Doz etkisi arasındaki ilişki laboratuvarımızda daha önce yapılan çalışmalarda da bulunmuştur. Ding, alkolik yağlı karaciğer farelerine 35, 70, 140 ve 210 mg/kg dozlarında COS uygulamış ve 70 ve 140 mg/kg gruplarının daha iyi koruyucu etkilere sahip olduğunu bulmuştur. Bu makalede seçilen 70 ve 140 mg/kg COS, çan şeklinin ortasında ve arkasında yer alabilir ve deneysel sonuçlar düşük doz grubunun yüksek doz grubuna göre biraz daha iyi etkilere sahip olduğunu göstermektedir.

Özet olarak, kitosan oligosakkaritler DSS ile indüklenen kolit semptomlarını etkili bir şekilde hafifletebilir. Bunlar arasında, 70 mg/kg kitosan oligosakkaritler, 140 mg/kg'a kıyasla kolon uzunluğu ve histopatolojik değişikliklerin giderilmesinde daha etkilidir ve insan kullanımı için önerilen dozaj olarak daha uygundur. Bu arada, kitosan oligosakkaritler nötrofil infiltrasyonunu hafifleterek ve pro-inflamatuar sitokinlerin salınımını engelleyerek inflamasyonu azaltmada ve IBD semptomlarını hafifletmede rol oynayabilir. Bununla birlikte, kitooligosakkaritlerin enflamatuar sitokinlerin salınımını engellemedeki spesifik etki mekanizmasının hala daha fazla doğrulanması gerekmektedir.