Simbiyotik yetiştirme yöntemi ile huperzin A'nın artan zenginleştirilmesinin teşvik edilmesi üzerine çalışma
Huperzia serrata (Thunb. ex Murray), Taxaceae familyasından Taxodium cinsine ait bir eğrelti otu bitkisidir. Travmatik yaralanmaların tedavisi, detoksifikasyon, ağrı kesici ve şizofreni tedavisinde kullanılan nadir bir Çin bitkisel ilacıdır. Yılan ayağı köknarı şu anda Alzheimer hastalığının tedavisi için en iyi araştırılan ilaçlardan biridir. Aktif bileşeni olan huperzin A, myastenia gravis ve Alzheimer hastalığının tedavisi için etkili, düşük toksisiteli, geri dönüşümlü ve oldukça seçici bir asetilkolinesteraz (AChE) inhibitörüdür. Dikkat, uyanıklık, konsantrasyon ve hafıza ile ilgili bir merkezi sinir nörotransmitteri olan asetilkolinin etkisini artırabilir. 1982 yılında huperzin A, yılan ayaklı köknardan başarıyla izole edilmiş ve "Umut Yıldızı" olarak kabul edilmiştir. Bir araştırmaya göre, 2025 yılına kadar gelişmiş ülkelerde 65 yaş ve üzeri Alzheimer hastalarının sayısı 2018'deki 5,5 milyondan yaklaşık 29%'lik bir artışla 7,1 milyona ulaşacak. Tıbbi bir atılım olmadığı takdirde, hastalığa yakalananların sayısı 2050 yılına kadar 5,5 milyondan 13,8 milyona çıkabilir. Sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde, her 100000 kişiden yaklaşık 14-20'si myastenia gravis hastasıdır ve toplamda yaklaşık 36000-60000 hasta vardır ki bu da oldukça endişe verici bir sayıdır. Alzheimer hastalığı ve myastenia gravis için şu anda piyasada bulunan ilaçlarla ilgili en büyük sorun ilaç toksisitesi ve direncidir. Mevcut ilaçlarla karşılaştırıldığında, huperzin A iyi güvenlikli, daha az yan etkiye sahip ve insan vücudu tarafından hızla emilebilen doğal bir bitki özüdür. İnhibisyon yöntemi, karışık bir rekabetçi ve rekabetçi olmayan inhibisyon türüdür ve terapötik etki, uzun bir etkili süre ile önemlidir.
Yılan ayaklı Cryptomeria tüm dünyaya yayılmıştır, ancak kaynakları çok sınırlıdır. Sınırlayıcı faktörlerden biri, sporlardan olgunluğa kadar en az 15 yıl süren yılan ayaklı Cryptomeria'nın yavaş büyümesidir. Ve olgunluk aşamasında, yılan ayaklı köknarın boyu sadece 10-30 cm'dir. Aynı zamanda, büyüme ortamının çoğaltılması ve gerçek yetiştirme süreçlerinde teşvik edilmesi zordur. Bu nedenle, yakın gelecekte yılan ayaklı köknar yok olma tehdidiyle karşı karşıya kalacaktır. Son yıllarda, bu nadir bitki üzerinde, eksplant ve kallus dokularının in vitro yetiştirilmesi gibi çok sayıda çalışma yapılmıştır. Kan'ichiro Ishiuchi'nin ekibi, H Pinifolia'nın kök ucundan eksplantlar elde etmiş ve steril ortamda 2 döngü boyunca (her döngü 7 gün) kültürlenmiştir. Son olarak, eksplantlar başarılı bir şekilde kallus büyüme ortamına aktarıldı. Buna ek olarak, araştırmacılar Huperzia serrata'nın kültür yönteminde ortam bileşenlerinin taranması ve kök ucu kültür teknolojisinin araştırılması gibi çeşitli iyileştirmeler yapmışlardır. Bununla birlikte, doku kültürü sürecinde eksplantların dezenfeksiyonu ve sterilizasyonu sorunu etkili bir şekilde çözülememiştir ve bu da huperzin A'nın büyük ölçekli üretimini sınırlamaktadır. Doğal kaynakların kıtlığı ve yukarıda belirtilen nedenlerden dolayı, huperzin A içeriğini daha düşük bir maliyetle artırabilecek yeni bir yöntem bulmaya acil ihtiyaç vardır.
Endofitik mantarlar, bitki kök ve yaprak dokularında yaşayan bir mantar türüdür. Araştırmalar, endofitik mantarların bitkilerle uzun süre simbiyoz halinde gelişmeleri halinde, genetik rekombinasyon yoluyla konukçu bitkinin bazı genlerini elde edebildiklerini ve konukçu bitkininkilerle aynı olan ikincil metabolitler üretebildiklerini ortaya koymuştur. Bu arada endofitik mantarlar, konukçu bitkilerin büyüme ve gelişimini desteklemek için hormon da üretebilir. Bu nedenle, birlikte kültür sisteminde, endofitik mantarlar elisitör olarak kabul edilir, bu da bitki hücrelerinin belirli bir konsantrasyon aralığında endofitik mantarlarla birlikte kültürlenebileceği anlamına gelir. Birlikte kültür sisteminde, endofitik mantarlar ve bitki hücreleri birbirleriyle etkileşime girerek bitkisel ürünlerin birikimini teşvik eder. Ergosterol, mantar hücre zarının önemli bir bileşeni ve mantarların karakteristik bir sterolüdür. Mantar biyokütlesini ölçmek için temsili bir gösterge olarak kullanılabilir.
Bu çalışma, Çin göknarının kaynak kıtlığı nedeniyle yaygın olarak kullanılamadığı mevcut durumu iyileştirmek amacıyla Çin göknarında huperzin A içeriğini ekonomik ve uygun bir şekilde artırmak için yeni bir ortak kültür sistemi (CCS) sunmaktadır.

Huperzine A, Alzheimer hastalığı ve myastenia gravis tedavisinde kullanılan bir AChE inhibitörüdür. Ana kaynağı Cryptomeria lanceolata'dır, ancak Cryptomeria lanceolata'daki Huperzine A içeriği düşüktür ve Cryptomeria lanceolata'nın sınırlı kaynakları farmasötik alanda daha fazla gelişmesini sınırlamaktadır. Bitkilerde çeşitli endofitik mantarların bulunduğunu ve bunların uzun süreli evrim sırasında konakçı bitkilerle karmaşık bir mutualistik ilişki kurduğunu gösteren çalışmalar vardır. Bir yandan, endofitik mantarların kendi hayatta kalma ihtiyaçlarını karşılamak için bitkilerden besin almaları gerekir. Diğer yandan endofitik mantarlar, konukçu bitkinin savunma sistemine karşı koymak için konukçu bitkilerle özel biyokimyasal iletişim kurarlar. Konukçunun kimyasal sinyallerini tanıyarak veya konukçu enzim sistemlerini kullanarak konukçuya benzer ikincil metabolitler sentezleyebilirler. Jiang ve arkadaşları, yarı kırmızı mangrov bitkisi Hibiscus'tan endofitik mantarları izole edip saflaştırmış ve katı hal fermantasyonu yoluyla konukçuyla aynı ikincil metabolitleri elde etmiştir. Tong ve arkadaşları, Cryptomeria serrata'daki endofitik mantar FS4'ün ikincil metabolitlerini izole edip incelemiş ve beş metabolitinin huperzin A'ya benzer güçlü inhibitör asetilkolinesteraz biyolojik aktivitesi sergilediğini bulmuştur.
Bu çalışmada, yabani yılanayağı baldıranının evcilleştirme koşulları ve doku kültürü ortamı koşulları üzerinde deneyler yapılmıştır. En uygun kültür koşulları 100 Lux ışık yoğunluğu, 95% nem, MS sıvı ortamı, 20.0g/L sükroz, 2,4-D5.0mg/L ve KT1.0mg/L olarak belirlenmiştir. CCS'nin dinamik büyüme sürecini yansıtmak için huperzine A ve ergosterol olmak üzere iki bileşiğin göreceli değişimleri kullanılmıştır. Dördüncü gün, dönüm noktasına dayalı olarak hasat ve alt kültür için en uygun zaman olarak belirlenmiştir. CCS ile 4 günlük ekimden sonra, huperzin A içeriği 49.34% artarak maksimum değerine ulaşmıştır. Kültür sistemindeki genel huperzin A içeriği önce artan sonra azalan bir eğilim göstermiştir. Bunun nedeni, büyümenin sonraki aşamasında, endofitik mantarların bitki hücresi farklılaşma yeteneğinden daha güçlü üreme yeteneğine sahip olması, kültür ortamındaki besinler ve büyüme alanı için rekabet etmesi ve hücre sayısında azalmaya neden olmasıdır. Bu nedenle, hasat ve alt kültür zamanının seçimi, ortak kültür sisteminde huperzin A'nın giderek zenginleşmesini sağlamanın anahtarıdır. Aynı zamanda, bitki hormonu 2,4-D konsantrasyonunun sistem üzerinde önemli bir etkisi vardır. 2,4-D, bitki organlarının farklılaşmasını ve kallus dokusunun indüklenmesini teşvik eder, ancak konsantrasyon çok yüksek olduğunda hücre farklılaşması üzerinde inhibe edici bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, kültür sisteminde optimum konsantrasyon olarak 5mg/L kullanılmıştır. Bu deney, huperzin A'nın biyosentezini sağlamak için bir ortak kültür sistemini başarıyla kullanmıştır. Bu yöntem, geleneksel sabit kavramların üstesinden gelir çünkü bitki somatik hücre kültürü önceden kapsamlı bir sterilizasyon gerektirmez. Bitki somatik hücreleri ve endofitik mantarlar birlikte kültüre alınabilir ve huperzin A üretimi belirli oranlarda teşvik edilebilir. Yetiştirme döngüsü doğru bir şekilde kavrandığı sürece, bu kullanışlı ve hızlı yöntem, bitki kaynaklarının korunması ve huperzin A'nın önemli biyoaktif maddelerinin zenginleştirilmesi için büyük önem taşıyan huperzin A'yı biriktirmek için kullanılabilir.