Emodin, Diyabet Nefropatili Farelerde Renal Oksidatif Hasarı Hafifletmek için MiR-21 Aracılı Otofajiyi Düzenliyor
Diyabet nefropatisi (DN), diyabetin en yaygın ciddi ikincil glomerüler hastalığı ve kronik böbrek yetmezliğinin yaygın nedenidir. Aşırı kan şekeri böbreklerde oksidatif stresi tetikleyerek böbreklerin iç hücrelerinde reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikmesine yol açabilir. Bu durum podositlerde, endotel hücrelerinde, tübüler epitel hücrelerinde ve mezangial hücrelerde oksidatif hasara neden olarak diyabetik nefropatinin oluşumunu ve gelişimini şiddetlendirebilir. Otofaji, ökaryotik hücrelerde hücre içi ortamın stabilitesini koruyan önemli bir iç yıkım mekanizmasıdır. Lizozomal proteinleri parçalayarak, hasarlı yapıları veya aşırı eksprese edilmiş proteinleri temizleyerek ve hücre yenilenmesini ve homeostazını sürdürmeye katılarak hareket eder. DN'nin patolojik ve fizyolojik süreçleri endoplazmik retikulum stresi, mitokondriyal disfonksiyon ve enflamatuar yanıt ile yakından ilişkilidir. Otofaji, yanlış katlanmış proteinleri ve hasarlı organelleri temizler, otofagozom oluşumunu ve otofaji lizozom füzyonunu teşvik eder ve endoplazmik retikulum stresini ve hücre apoptozunu hafifletir. Oksidatif stres altında üretilen ROS, serbest radikalleri temizleyebilen ve böbrek dokusu ve hücrelerine oksidatif stres hasarını hafifletebilen otofajiyi indükleyebilir. Otofaji, hücreler için hayatta kalmayı destekleyen önemli bir mekanizmadır. Otofajiyi etkili bir şekilde indüklemek ve enflamatuar süreci kontrol etmek DN tedavisi için etkili stratejilerdir.

Son yıllarda yapılan çalışmalar, mikroRNA'ların (miRNA'lar) DN hastalarında anormal şekilde ifade edildiğini ve mezanjiyal ekstraselüler matriks (ECM) agregasyonu ve podosit hasarı gibi patolojik süreçlere, özellikle de sıcak bir araştırma konusu haline gelen mikroRNA-21 (miR-21)'e katıldığını göstermiştir. MiR-21 yaygın olarak bulunur ve hücre farklılaşmasını, proliferasyonunu ve apoptozu düzenler. Yurtiçinde ve yurtdışında yapılan çok sayıda çalışma, DN hastalarında serum miR-21 konsantrasyonunun normal bireylere göre önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ve miR-21'in DN hastalarının böbrek dokusu biyopsilerinde renal tubulointerstisyel fibrozis ile pozitif korelasyon gösterdiğini ortaya koymuştur. Bu nedenle, miR-21'in susturulması veya ifadesinin engellenmesi, diyabetin uzun veya kısa vadeli komplikasyonlarının önlenmesinde büyük önem taşımaktadır. MiR-21'in Akt/mTOR ve PTEN gibi sinyal yolaklarını modüle ederek hücresel otofajiyi düzenlediği bildirilmiştir. Bununla birlikte, miR-21 aracılı otofajiyi düzenleyerek diyabet nefropatisinde renal oksidatif hasarı azalttığına dair bir rapor bulunmamaktadır.

Emodin (EM), Polygonaceae bitkilerinden Rheum palmatum L., Rheum tanguticum Maxim. ex Balf. ve Rheum officinale Baill'de bulunan etkili bir etken maddedir. Antrakinon bileşik sınıfına aittir ve antibakteriyel, anti-enflamatuar, immün regülasyon, anti-tümör ve böbrek fonksiyonlarını iyileştirme gibi farmakolojik etkilere sahiptir. Önceki çalışmalar, emodinin glomerüler membran hücrelerinin yüksek glikoz kaynaklı proliferasyonunu inhibe ederek ve mezangial hücrelerin apoptozunu teşvik ederek diyabetik nefropatinin ilerlemesini geciktirebileceğini bulmuştur. Ön deneysel sonuçlar ayrıca 25 mmol/L glukozun glomerüler mezangial hücrelerde miR-21 ekspresyonunu önemli ölçüde destekleyebileceğini göstermiştir. Bu çalışma, miR-21 aracılı otofajiyi düzenleyerek diyabet nefropatisi farelerinde renal oksidatif hasarı hafifletmede emodin mekanizmasını araştırmayı amaçlamaktadır.

Farelerde diyabet nefropatisi modeli, yüksek şekerli ve yüksek yağlı diyet artı streptozotosinin intraperitoneal enjeksiyonu ile oluşturulmuştur. Başarılı fareler rastgele model grubu, glimepirid grubu (0.6 mg/kg/gün, ig), emodin yüksek doz grubu (50 mg/kg/gün, ig), emodin düşük doz grubu (25 mg/kg/gün, ig) ve normal gruba (her grupta 10 adet) ayrılmıştır. Bir haftalık tedaviden sonra, her deney grubu farede kan şekeri, böbrek ağırlık katsayısı ve patolojik morfoloji ölçülmüştür; Böbreklerdeki ROS içeriğini ölçmek için floresan prob yöntemi kullanılırken, böbreklerdeki BUN, Cr ve uAE içeriğini ölçmek için Elisa yöntemi kullanılmıştır; Böbrek hücrelerinde otofaji derecesini gözlemlemek için transmisyon elektron mikroskobu kullanılmış ve P62, Atg7 ve LC3 proteinlerinin ekspresyonunu ölçmek için Western blot kullanılmıştır. Temsili sonuçlar aşağıdaki gibidir.

Oksidatif stres ve apoptoz, diyabet nefropatisi olan hastaların böbrek dokularında ve hayvan modellerinde doğrulanmıştır. İn vitro deneyler de yüksek glikoz ortamının podositlerin oksidatif stres, apoptoz, inflamasyon ve diğer olaylara maruz kalmasına neden olabileceğini bulmuştur. Renal podositler, glomerüler filtrasyon bariyerinin bütünlüğünün korunmasında ve glomerüler geçirgenliğin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Bu süreçte, glomerüler podosit otofajisi diyabet nefropatisinin patogenezi ile yakından ilişkilidir. Podositlerin otofaji aktivitesi değiştiğinde, aşırı aktive olduğunda veya inhibe edildiğinde, podositlerde enflamatuar hasara ve filtrasyon bariyerinde hasara neden olabilir. Bu deneyde, DN farelerin böbreğindeki podosit otofajisinin ciddi şekilde yetersiz olduğunu ve ROS'un önemli ölçüde arttığını da gözlemledik. ROS, podositlerin mitokondrisinde bulunan bir sinyal molekülüdür ve diyabet ve komplikasyonlarının oluşumu ve gelişimi için başlangıç halkasıdır. ROS üretiminin azaltılması, DN'nin ilerlemesini önlemek için potansiyel bir yöntemdir. Farelere oral emodin uygulamasından sonra, renal ROS'ta önemli bir azalma ve otofajide bir artış gözlemledik, bu da renal inflamatuar patolojik hasarda önemli bir azalma ve BUN, Cr ve uAE seviyelerinde önemli bir düşüş gibi bir dizi kademeli reaksiyonda iyileşmeye yol açtı. Bu nedenle, fare böbreklerinde yüksek glikoz kaynaklı ROS'u temizlemek için otofajiyi teşvik etmek, emodinin DN farelerini iyileştirmesi için önemli bir mekanizma olabilir. Bu arada, Glim'in DN farelerinde BUN, Cr ve uAE seviyelerini önemli ölçüde azaltabildiğini de gözlemledik. Glim, pankreatik beta hücrelerinin yüzeyindeki sülfonilüre reseptörlerine bağlanarak ve in vivo olarak eşit ve yavaş bir şekilde salınarak etki eden sülfonilüre bazlı bir hipoglisemik ilaçtır. Aynı zamanda Glim, çevre dokuların insüline duyarlılığını artırabilir ve insülin direncini iyileştirebilir. Glikozun çevre dokular tarafından kullanımı artar ve kan glikoz seviyeleri önemli ölçüde düşer. Kan şekeri standardına ulaştıktan sonra, glikasyon son ürünlerinin üretimi azalır ve böbreklere verilen hasar azalır.

Geniş spektrumlu bir gen olan MiR-21'in diyabetik nefropatinin başlangıcı ile pozitif ilişkili olduğu kanıtlanmıştır. Hem ulusal hem de uluslararası literatür, miR-21'in TGF - β/Smad, PTEN/Akt ve MMP-S/TIMPS gibi sinyal yolaklarına aracılık ederek diyabetik nefropatinin oluşumuna ve gelişimine katılabileceğini göstermiştir. Otofaji açısından, miR-21'in renal podositlerde otofajiyi inhibe etmek ve diyabetik nefropatinin patogenezini şiddetlendirmek için Akt/mTOR sinyal yoluna müdahale edebileceğine dair literatür raporları da bulunmaktadır. Bu kanıtlar, miR-21'i inhibe etmenin ve aşağı akış yollarını düzenlemenin DN'yi iyileştirmek için etkili bir strateji olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada ayrıca, DN farelerin böbreklerinde miR-21 ekspresyonunun normal gruba kıyasla önemli ölçüde arttığı gözlemlenmiştir; bu da DN farelerin böbreklerindeki zayıflamış otofaji ile ilişkili olabilir. DN dışı hastalıklarda, miR-21'in otofajinin negatif düzenlenmesi yoluyla pulmoner fibroz, makrofajlar ve hipoksik oval hücreler gibi yaşamsal faaliyetlere katıldığı da gösterilmiştir. Emodin uygulamasından sonra, DN farelerin böbreklerinde miR-21 ekspresyonu önemli ölçüde aşağı doğru düzenlenirken, otofaji inhibisyonu hafiflemiştir. Bununla birlikte, emodinin doğrudan otofajiye aracılık edip etmediği veya miR-21 aracılı hücresel otofajiyi düzenleyip düzenlemediği, hedef gen tahmin analizi yoluyla doğrulanmalıdır, çünkü bazı araştırmacılar emodinin otofajiyi lizozomal ve mitokondriyal yollarla düzenleyebileceğini bildirmiştir, ancak bunun miR-21'i düzenlemekle ilgili olup olmadığı daha fazla araştırma gerektirir.

Otofaji mekanizmalarını keşfetmek açısından, üç klasik otofaji belirteç proteini olan P62, Atg7 ve LC3'ün ekspresyonunu tespit ettik. Bu üç protein, hasarlı organellerin, denatüre proteinlerin ve diğer biyomoleküllerin ortadan kaldırılmasında ve parçalanmasında önemli bir rol oynayan ve hücreler için önemli bir onarım mekanizması olan otofagozomal yolun kilit üyeleridir. Bu nedenle, DN farelerde emodin ile artan otofaji ve renal patolojik ve fizyolojik fonksiyonların iyileşmesinin otofagozomal yolakla ilişkili olabileceğini düşünüyoruz. Sonuçlar, DN farelerin böbreklerinde P62, Atg7 ve LC3 proteinlerinin ekspresyonunun emodin uygulamasından sonra arttığını göstermiştir; bu da emodinin DN farelerin böbreklerini korumak için renal podositlerin otofaji lizozom yolu üzerinde etkili olabileceğini düşündürmektedir.