Biyoinformatik Taramaya Dayalı Olarak Pankreas Kanserinin Farklı Genleri ve İmmün İstila Mekanizması ile Hedeflenen Geleneksel Çin Tıbbının Tahmin Edilmesi
Pankreatik duktal adenokarsinomun (PDAC) küresel yükü son 25 yılda iki kattan fazla artmıştır ve 2030 yılına kadar kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni olması beklenmektedir. PDAC hastalarının ortalama beş yıllık sağkalım oranı sadece 8%'dir ve hastaların 71% gibi yüksek bir oranı tam cerrahi rezeksiyondan sonra bile nüks riskiyle karşı karşıyadır. Yüksek ölümcüllük ve yüksek nüks oranına sahip bu tümör özelliği, PDAC'nin immün efektör hücrelerin tümör içine sızmasını önleyen ve pankreas kanseri hücrelerinin immün gözetimden kaçmasını sağlayan sıkı matris bileşeni (fiziksel bariyer) tarafından belirlenir. Günümüzde birçok klinik çalışma, immün kontrol noktası inhibitörleri, kanser aşıları, adoptif hücre metastazı vb. dahil olmak üzere immünoterapi yoluyla PDAC hastalarının genel etkinliğini artırmaya çalışmaktadır. Monoklonal antikor tedavisinin klinik etkinliği zayıftır ve herhangi bir ilerleme kaydedilmemiştir.

Yüksek verimli genetik analizin ortaya çıkmasıyla birlikte, gen ekspresyon profili oluşturma, çeşitli hastalıklarda farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlamak için etkili bir yöntem haline gelmiştir. CIBERSORT, bir numunedeki immün hücrelerin ekspresyonunu değerlendirmek ve çeşitli immün hücre oranları elde etmek için mikroarray verilerini veya RNA dizileme verilerini kullanan analitik bir araçtır. PDAC'de diferansiyel olarak ifade edilen genler üzerinde çok sayıda biyoinformatik analiz yapılmış olmasına rağmen, özellikle bitkisel ilaçların terapötik potansiyeli açısından, bağışıklık mekanizmaları ve terapötik hedef tahmini konusunda daha derinlemesine araştırma eksikliği vardır. Geleneksel Çin tıbbı, PDAC ile ilişkili sarılık ve asit gibi yaygın hastalıklar hakkında sistematik bir anlayış oluşturmuştur. Aynı zamanda, geleneksel Çin tıbbı, çoklu hedefin doğal avantajıyla, daha fazla araştırmaya değer olan karmaşık bağışıklık mikro ortamlarına etkili bir şekilde müdahale edebilir. Bu nedenle, bu çalışmada korelasyon analizi için PDAC hastalarından eşleştirilmiş doku örneklerini seçmek üzere Gen Expression Omnibus (GEO) veri tabanı kullanılmıştır. Hastalık mekanizması genetik düzeyde araştırılmış, sağkalım farklılıkları ve bağışıklık ile ilgili analizler yapılmıştır. PDAC dokularındaki immün hücre infiltrasyon modelini göstermek için CIBERSORT dekonvolüsyon algoritması kullanılmıştır. Son olarak, potansiyel etkili geleneksel Çin ilaçları kapsamlı bir şekilde tahmin edilmiş ve taranarak klinik ilaç seçimi ve geliştirilmesi için bir temel sağlanmıştır.

Günümüzde, pankreas kanserinin immünoterapisi bazı ilerlemeler kaydetmiş ve bu da pankreas kanserinin klinik tedavisine umut getirmiştir. Bununla birlikte, pankreas kanserinin mikro ortamı genellikle immünosupresif hücre çoğalması, immün hücre inaktivasyonu ve düşük tümör mutasyon yükü içerdiğinden, immünoterapi sonuçlarının çoğu tatmin edici değildir. Yüksek verimli teknolojinin gelişmesiyle birlikte, Lv ve arkadaşları pankreas kanserinin diferansiyel çekirdek genlerini çıkarmak için çoklu veri setleri kullanmış, Xiao ve arkadaşları geleneksel Çin tıbbını çıkarmak için "inflamasyon kanseri" diferansiyel genlerini kullanmış, vb. bunların hepsi pankreas kanserinin moleküler mekanizmasına ilişkin anlayışlarını derinleştirmiştir. Bununla birlikte, bu hastalığın bağışıklıkla ilgili mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar yetersizdir ve bu da hastaların uzun vadeli sağkalım prognozunu iyileştirmeye elverişli değildir. Bu nedenle, bu çalışma, mekanizmaları iyileştirmeyi ve ilaç geliştirmeyi teşvik etmeyi amaçlayan, ilgili bağışıklık infiltrasyon mekanizmalarını ve diferansiyel genlere dayalı potansiyel etkili geleneksel Çin tıbbını daha fazla araştıran ilk çalışmadır. İlk olarak, bu çalışma GEO veri tabanı aracılığıyla uygun gen çiplerini taramış ve aynı hastadan alınan pankreas tümörü ve normal doku örneklerinin gen ekspresyon profillerini karşılaştırarak 2653 diferansiyel olarak ifade edilen gen elde etmiştir. Hücre dışı matris dokusu ve kolajen lif dokusu ile ilgili genler (COL1A2, COL1A1, COL3A1, COL5A1, COL5A2), ADAM metallopeptidaz (ADAMTS2), bazal membran polisakkarit (LUM), integrin alt birimi alfa 2 (ITGA2), fibronektin (FN1) ve matris metalloproteinaz (MMP2) dahil olmak üzere PPI aracılığıyla çekirdek diferansiyel olarak ifade edilen genler tanımlanmıştır. Yukarıda farklı şekilde ifade edilen genlerin tümör dokularında yukarı doğru düzenlendiği, kolajen metabolizmasıyla ilişkili olduğu ve çoğunlukla COL1, COL3 ve COL5 ailelerine ait olduğu kanıtlanmıştır. Bunlar arasında, COL1A2'nin ekspresyonunun qRT PCR ile dokuda en yüksek olduğu doğrulanmış ve bu sonucun yüksek güvenilirliğini göstermiştir. Diğer solid tümörlerin aksine, PDAC tümör mikroçevresi pankreatik stellat hücreleri, kanserle ilişkili fibroblastlar, immün hücreler ve hücre dışı matriksin aşırı fibrozisini içeren yoğun bir matriks ortamıdır. Matristeki yoğun fibrozis yanıtı ve tümörün bağışıklık ortamındaki değişiklikler, PDAC tedavisinin mevcut başarısızlığının ana nedenleri olarak kabul edilmektedir. Daha ileri sağkalım analizi, bu çekirdek diferansiyel olarak ifade edilen genlerin PDAC hastalarında RFS ile önemli ölçüde korele olduğunu ve çeşitli tümör hücrelerinin infiltrasyon derecesi ile pozitif korelasyon gösterdiğini ortaya koyarak, bu genlerin tümör immün mikroçevresini değiştirerek PDAC hastalarının klinik prognozuna aracılık edebileceğini düşündürmektedir. Bu noktanın klinik sonuçları değiştirmek için nasıl kullanılacağı olası atılımlardan biri haline gelmiştir.
Diferansiyel olarak ifade edilen genlerin daha ileri GO ve KEGG zenginleştirme analizi, biyolojik süreçlerinin nötrofil degranülasyonu, göç, kemokinler, T yardımcı hücre farklılaşması, humoral immün yanıt ve diğer süreçleri içerdiğini göstermektedir. PDAC mikroçevresi esasen enflamatuardır ve kemokinlerin ve diğer faktörlerin tümörlerin enflamatuar mikroçevresini desteklediği gerçeği de kanıtlanmıştır. Sitokinler ve kemokinlere ek olarak, nötrofillerin aktivasyonu genellikle ilk moleküler olaydır ve bunu tümör dokusuna doğru göç takip eder. PDAC kanser hücrelerinin polimorfonükleer nötrofilleri tümör çevresine toplayabildiği, ancak bunların çoğunun anti-tümör yanıtları üretemediği açıktır. Tipik olarak, yüksek nötrofil bolluğu PDAC'nin ilerlemesini teşvik eder ve kötü prognozla ilişkilidir; Son in vitro deneyler, pankreas kanseri hücrelerinin nötrofillerin hücre dışı tuzaklarının oluşumunu indüklediğini ve böylece PDAC'nin karaciğer mikrometastazının oluşumunu teşvik ettiğini göstermiştir; Aynı zamanda, yüksek fibrozisin neden olduğu lokal hipoksi, bağışıklık ortamını belirler ve reaktif oksijen türlerinin sürekli salınımı lokal hipoksiye yol açar, böylece nötrofil infiltrasyonunu arttırır. Bu nedenle, nötrofiller pankreas kanserinin mikroçevresinde çok önemlidir. Ayrıca, bu çalışmanın sonuçları, farklı şekilde ifade edilen genlerin T hücre farklılaşması ve humoral immün düzenlemede doğrudan rol oynadığını göstermektedir.

PDAC patogenezinde immün infiltrasyonun rolünü daha fazla araştırmak için, bu çalışmada genel tümör örneklerini analiz etmek için CIBERSORT dekonvolüsyon yöntemi kullanılmıştır. Normal pankreas dokusuyla karşılaştırıldığında, M2 makrofajları ve istirahat halindeki bellek CD4+T hücreleri tümör dokusunda önemli ölçüde artarken, CD8+T hücreleri önemli ölçüde azalmıştır. Aynı eğilim eşleştirilmiş örneklerde de gözlenmiştir. M2 makrofajları, pankreas kanserinin kötü prognoz göstergelerinden biri olduğu doğrulanan tümör ilerlemesini destekleyen anti-enflamatuar sinyaller üretir. 2013 yılında, IHC yoluyla PDAC hastalarında immün hücre infiltrasyonunun derecesini gözlemleyen bir çalışma, daha yüksek seviyelerde tümör infiltre eden pan makrofaj M2, Treg ve CD4+T'nin daha kısa sağkalım ile önemli ölçüde ilişkili olduğunu göstermiştir. PDAC fare modelinde, tümörle ilişkili makrofajların sitokinler, proteazlar ve büyüme faktörleri salgılayarak immün baskılama ve anjiyogeneze aracılık ettiği ve tümör ilerlemesini teşvik ettiği gösterilmiştir. Ayrıca, CCR2'nin inhibisyonunun kemoterapi etkinliğini artırdığı, metastazı engellediği, radyoterapi etkinliğini artırdığı ve monositlerin tümör mikroçevresine alınmasını engelleyerek T hücresi immün infiltrasyonunu artırdığı gösterilmiştir. Bu nedenle, makrofajların insan PDAK'ına yönelik yeni terapötik stratejiler için potansiyel hedefler haline gelme olasılığı yüksektir. Daha önce fibroblastlar ve fibroblastlardan oluşan PDAC immünosupresif mikroçevresinin T hücrelerinin infiltrasyonunu sınırlayacağına inanılıyordu, ancak son araştırmalar T hücrelerinin spesifik uzaysal dağılımını ortaya çıkarmıştır, çünkü korelasyon ısı haritası pankreas kanseri dokusunda istirahat hafızası CD4+T hücreleri ile CD8+T hücreleri arasında önemli bir negatif korelasyon olduğunu göstermektedir (r=-0,64) ve bunun özellikle PDAC olmak üzere kötü prognoz göstergelerinden biri olduğu kanıtlanmıştır. Tümör dokusunda CD8+T hücrelerinin infiltrasyonu, tümör hücreleri ve hasta sağkalım oranı ile yakından ilişkilidir. Son zamanlarda akademisyenler, uzun süreli sağkalanlarda başarılı bir bağışıklık oluşturmanın tümör içinde yüksek miktarda CD8+T hücresi gerektirdiğini vurgulamışlardır. CD8+T hücrelerinin itici faktörlerinin ve CD8+T hücrelerinin infiltrasyon mekanizmasının anlaşılması, PDAC tedavi planlarının daha da geliştirilmesi için çok önemlidir. Şu anda, PDAC immün infiltrasyon hücreleri arasındaki ilişkinin geniş ölçekli doğrulaması eksiktir ve bu tahminin belirli bir referans önemi vardır.
Geleneksel Çin tıbbında PDAC, "dalak birikimi", "hedeflenen qi", "birikim", "qi durgunluğu" ve "fu liang" kategorilerine aittir. Vaka serisi literatür araştırması ve meta-analiz sonuçları, PDAC için kombine geleneksel Çin tıbbı tedavisinin hasta mortalitesini etkili bir şekilde azaltabileceğini ve uzun vadeli prognozu iyileştirebileceğini göstermektedir. Son temel araştırmalar, PDAC tedavisinde geleneksel Çin tıbbı mekanizmasının esas olarak tümör mikroçevresini iyileştirerek dolaylı olarak tıbbi sonuçları iyileştirdiğini ortaya koymuştur. Bu nedenle, tümör immün mikroçevresinin araştırılması, etkili geleneksel Çin tıbbı bulmak için çok önemlidir. Şu anda, geleneksel Çin tıbbında PDAC patogenezinin çoğunlukla nemli ısı ve toksin birikimine odaklanan "köken eksikliği ama öz fazlalığı" olduğuna inanılmaktadır. Ancak bu çalışma, geleneksel Çin tıbbının etkinliğinin esas olarak ısı temizleme (Scutellaria baicalensis, Sagittaria angustifolia, şakayık kabuğu, mor ot vb.) kategorisine ait olduğunu ve bunu geleneksel Çin tıbbının patogenezine uygun tonik ilaçların (ginseng, eucommia ulmoides, limon otu, kaplumbağa kabuğu, eşek derisi tutkalı vb. Hastalığın yeri açısından bakıldığında, eski Çin tıbbı kitaplarındaki anatomik yer ve fizyolojik işlev tanımlarıyla karşılaştırıldığında, çoğu bilim adamı pankreasın beş organ arasında dalağa atfedilmesini desteklemektedir. Ancak bu çalışma, geleneksel Çin tıbbının etkili tahminlerinin büyük çoğunluğunun karaciğer meridyenine ait olduğunu, bunu akciğer ve böbrek meridyenlerinin izlediğini göstermekte ve belki de karaciğer teorisinden gelen nemli ısının dalak eksikliğine yardımcı olmakla birlikte tedavi edilmesinin tedavi etkinliğini daha da artırabileceğini düşündürmektedir. Araştırmanın ardından, bu teorinin dağınık deneyimlere ve inceleme raporlarına sahip olduğu ve sistematik bir anlayış oluşturmak için daha fazla araştırmaya değer olduğu görülmüştür. Buna ek olarak, bu çalışmada birkaç geleneksel Çin ilacı elde etmek için ters tahmin kullanılmıştır. Yüksek korelasyona sahip Çin tıbbı sıraları arasında, ginsenosidlerin MMP2 ve diğer faktörlerin ekspresyonunu aşağı çekerek anjiyogenezi ve tümör hücresi beslenme kaynağını azaltabileceği bulunmuştur; Curcumin, Wnt/β - Catenin sinyal yolunun aktivitesi yoluyla PDAC kök hücrelerinin kendini yenilemesini inhibe eder ve PDAC subkutan transplant tümör modeli dokusunda lokal mikrosirkülasyonu iyileştirebilir, tümör mikroçevresinde kan ve oksijen tedarikini artırabilir ve tümör hücrelerinin ve stromal hücrelerin hipoksik stres yanıtını inhibe edebilir; Yukarıdaki literatür, bu çalışmanın öngörülen sonuçlarından bazılarını desteklemektedir, ancak PDAC'nin geleneksel Çin tıbbı tedavisi ile ilgili bağışıklık mekanizmaları konusunda hala araştırma eksikliği vardır.
Bu çalışma, gen çiplerini tararken bağışıklık mekanizması analizindeki bireysel farklılıkları dikkate almış ve eşleştirilmiş örnek analizi kullanarak PDAC deneysel verilerini titizlikle taramıştır. Aynı zamanda, bu çalışmanın esasen önceki tek GSE verilerinin ikincil bir madenciliği olduğu düşünüldüğünde, çekirdek diferansiyel olarak ifade edilen genlerin ifadesini doğrulamak için farklı seviyeler kullanılmış ve risk azaltılmıştır. Bununla birlikte, bu çalışma hala aşağıdaki eksikliklere sahiptir: (1) Küçük örneklem boyutu nedeniyle, veri analizinin belirli önyargıları vardır ve sonraki aşamada analiz için gereksinimleri karşılayan daha fazla veri seti dahil edilecektir; (2) CIBERSORT dekonvolüsyon algoritması analizi, hücresel heterotipik etkileşimlerden, hastalığı tetikleyen faktörlerden ve hastalık fenotiplerinin plastisitesinden sapabilen sınırlı genetik verilere dayanmaktadır. Klinik ve temel çalışmalar bireysel bağışıklık durumunu daha kapsamlı ve objektif bir şekilde yansıtabilir. Özetle, bu çalışma PDAC'nin immün infiltrasyon mekanizmasını keşfetmek ve bu alanda gelecekteki araştırmalar için belirli bir değere sahip olan potansiyel etkili geleneksel Çin ilaçlarını tahmin etmek için CIBERSORT dekonvolüsyon algoritması ile birlikte biyoinformatik tekniklerini kullanan ilk çalışmadır.