Lingzhi Ergothionein'in Yüksek Verimli Tespit Yöntemi Üzerine Araştırma
2-tiyo-Lhistidin trimetil iç tuzu olarak da bilinen ergothioneine (EGT), birçok hayvan ve bitkide bol miktarda bulunan doğal bir amino asittir. Sadece bazı mikroorganizmalarda (aktinomisetler, streptomisetler), mantarlarda ve bazı siyanobakterilerde sentezlenir ve hayvansal organizmaların kendileri tarafından sentezlenemez. İnsan vücudu EGT'yi yalnızca gıdalardan alabilir ve son derece spesifik organik katyon taşıyıcı yeni tip-1 (OCTN1) aracılığıyla çeşitli hücre ve dokularda yüksek konsantrasyonlarda EGT biriktirebilir. EGT güçlü bir antioksidan olarak kabul edilir ve Servillo ve arkadaşları, benzersiz bir redoks mekanizmasına sahip olduğuna inanarak antioksidan mekanizmasını araştırmış ve EGT'nin hücrelerde benzersiz bir antioksidan etkisi olduğunu öne sürmüştür. EGT'nin standart oksidasyon-redüksiyon potansiyeli -0,06V iken, diğer tiyollerin potansiyeli genellikle -0,32V ile -0,2V arasındadır. Bu nedenle EGT, fizyolojik pH ortamlarında diğer antioksidanlara göre daha kararlıdır ve spontane oksidasyona daha az eğilimlidir. Araştırmalar, EGT'nin anti-enflamatuar etkiler; DNA'yı koruyarak elde edilen hücre koruma işlevi; nöronal farklılaşmayı ve nörogenezi teşvik ederek elde edilen antidepresan işlevi; oksidatif strese direnerek elde edilen göz koruma işlevi gibi birçok önemli fizyolojik işlevi olduğunu göstermiştir; Ateroskleroz ile ilgili adezyon moleküllerinin ekspresyonunu keserek elde edilen kardiyovasküler ve serebrovasküler koruma işlevi; EGT, toksisiteyi inhibe ederek elde edilen nörodejeneratif hastalıklar üzerindeki önleyici ve terapötik etkileri ve doğal güvenliği nedeniyle tıp, gıda ve kozmetik gibi endüstrilerde geniş bir uygulama alanına sahiptir.

EGT üretim yöntemleri arasında kimyasal sentez, yenilebilir mantar ekstraksiyonu ve mikrobiyal fermantasyon yer almaktadır. İlk ikisinin yüksek maliyeti ve karmaşık süreci nedeniyle, yenilebilir mantar hiflerinin derin fermantasyonu şu anda EGT endüstriyel üretiminin ana modudur. Bununla birlikte, doğal suşlar düşük EGT üretimine sahiptir ve ıslah teknikleri yoluyla yüksek verimli endüstriyel EGT suşlarının yetiştirilmesi gerekmektedir. Endüstriyel yenilebilir mantar türlerini yetiştirme yöntemleri arasında mutajenez ıslahı, hibridizasyon ıslahı, genetik mühendisliği ıslahı ve protoplast füzyon ıslahı yer almaktadır. Bununla birlikte, her bir ıslah yöntemi çok sayıda büyük ölçekli EGT içerik testi gerektirir. Islah sürecinde EGT içerik testinin öneminin daha çok örnekler arasındaki içeriği karşılaştırmak olduğu unutulmamalıdır. Şu anda, EGT için tespit yöntemleri arasında yüksek performanslı sıvı kromatografisi, yüksek performanslı kapiler elektroforez ve ince tabaka elektroforezi bulunmaktadır. En yaygın kullanılan yöntem, karmaşık malzeme sistemlerinden EGT içeriğini doğru bir şekilde tespit edebilen yüksek performanslı sıvı kromatografisidir. Bununla birlikte, yüksek performanslı sıvı kromatografisinin bariz eksiklikleri vardır, yani farklı numuneler için farklı tespit koşullarını keşfetmesi gerekir. Ayrıca, EGT'nin geç pik zamanı ve pahalı standart numuneler nedeniyle, üremede çok sayıda numuneden yüksek verimli numunelerin taranması, EGT'nin geliştirilmesini ve uygulama araştırmasını büyük ölçüde engelleyen uzun tespit süresine ve yüksek maliyete yol açabilir. Bu nedenle, örnekler arasındaki EGT konsantrasyonunu doğru bir şekilde belirleyebilen yüksek verimli hızlı bir tespit yönteminin oluşturulması acildir.
Güçlü antioksidan özellikleri ve iki değerlikli demir iyonlarına orta derecede indirgenebilirliği (havadaki oksijenle temastan etkilenmez veya zayıf indirgenebilirlik nedeniyle indirgenmez) nedeniyle EGT iki değerlikli demir iyonlarıyla reaksiyona girerek renksiz şelatlar oluşturabilirken tiyosiyanat iyonları iki değerlikli demir iyonlarıyla reaksiyona girerek kırmızı kompleksler oluşturur. Bu özelliklere dayanarak, demir tiyosiyanat bu çalışmada indirgeyici ajan olarak seçilmiş ve ergotamin standardı ergotamin için yüksek verimli bir tespit sistemi kurmak üzere demir tiyosiyanatla reaksiyona girmek için kullanılmıştır. Aynı zamanda, yüksek verimli tespit sistemi farklı Ganoderma lucidum suşlarının EGT verimleri değiştirilerek doğrulanmıştır. Bu çalışmanın sonuçları yüksek verimli EGT mikroorganizmalarının taranması ve yeni yüksek verimli EGT suşlarının ıslahı için yeni yöntemler ve fikirler sağlayacaktır.

Ergothionein'in güçlü indirgeyici fizikokimyasal özelliklerine dayanarak, EGT tiyosiyanat demir sistemini oluşturmadan önce, alkali potasyum permanganat sistemi, bromokresol yeşili sistemi, mavi şişe metilen mavisi sistemi, guaiacol sistemi ve ferrik klorür EGT sistemi oluşturmak için deneyler yapılmıştır. Sonuçlar, alkali potasyum permanganat sisteminin düşük stabilite nedeniyle başarısız olduğunu; bromokresol yeşili sisteminin renk gelişiminin pH bağımlılığı nedeniyle başarısız olduğunu; mavi şişe metilen mavisi sisteminde, indirgenmiş haldeki metilen mavisinin güçlü indirgenebilirliği nedeniyle, havadaki oksijenle temas ettiğinde kolayca metilen mavisine oksitlendiğini ve bunun da herhangi bir fenomen olmaksızın deneyin başarısız olmasına neden olduğunu; guaiacol sisteminin de güçlü indirgenebilirlik ve oksijen temasından kaynaklanan parazit nedeniyle başarısız olduğunu; ferrik klorür sisteminin düşük renk oluşturma nedeniyle başarısız olduğunu göstermiştir. EGT demir tiyosiyanat sistemi, EGT için yüksek verimli tespit yöntemlerinin incelenmesi için kullanılabilir.

EGT tiyosiyanat demir tespit sisteminin yapımı sırasında, test edilen numune sıradan EGT ham ekstraksiyon yöntemi, yani alkol çökeltme azot üfleme sabit hacim ekstraksiyonu kullanılarak ekstrakte edildiğinde, ekstraksiyon çözeltisindeki kalıntı fenolik maddelerin sistemin renk reaksiyonunu etkileyeceği ve hassasiyetini azaltacağı bulunmuştur. Bu nedenle, azot üflemeli sabit hacim ekstraksiyonundan sonra, ham ekstraksiyon çözeltisine bir kloroform fenol giderme adımının eklenmesi gerekir.
Ganoderma lucidum, Çin'de çeşitli biyoaktif maddeler ve fizyolojik işlevler içeren geleneksel ve değerli bir tıbbi mantardır. Ergothionein içeriği birçok yenilebilir mantar arasında nispeten yüksektir, ancak ticari olarak üretilen bir tür olarak verimi hala düşüktür. Bu nedenle, yüksek ergothionein üretimine sahip yeni bir Ganoderma lucidum türünün yetiştirilmesi büyük önem ve pratik uygulama değeri taşımaktadır. Yukarıdaki nedenlere dayanarak, laboratuvarımız protoplast füzyon rejenerasyonu, izolasyonu ve tanımlanması yoluyla bir grup sözde füzyon ürünü elde etmiştir. Bu yöntemin doğrulama sürecinde kullanılan Ganoderma lucidum füzyon ürünlerinin tümü bu kaynaktan elde edilmiştir.
Bu çalışmada oluşturulan yöntem EGT'nin fiziksel ve kimyasal özelliklerine dayanmaktadır ve tespit sistemi hassas ve kararlıdır. EGT üreten endüstriyel fermantasyon suşlarının ıslah sürecinde büyük miktarlarda numunenin hızlı bir şekilde karşılaştırılması için uygundur. Teorik olarak, suşların büyük çoğunluğunda EGT içeriğinin yüksek verimli hızlı tespitini sağlamak, orijinal EGT araştırmasının sınırlamalarını kırmak ve EGT'nin genel gelişimi ve uygulama araştırması için yeni yöntemler ve fikirler sağlamak için sadece basit örnek EGT ekstraksiyon optimizasyonu gereklidir.