Akut hipotermiye maruz kalan farelerin iskelet kasında sülforafanın Nrf2 aracılı antioksidan kapasite üzerine etkisi
İskelet kası, düşük sıcaklık koşullarında vücutta ısı üretimi için önemli bir organdır. İskelet kasları, düşük sıcaklıktaki ortamlarda hem titreyerek hem de titremeden ısı üretimi yoluyla vücut sıcaklığı homeostazını korur. Bu süreç, kimyasal enerjisini vücudun ihtiyaç duyduğu termal enerjiye dönüştürmek için büyük miktarda ATP'nin hidrolizini gerektirir. İskelet kası, düşük sıcaklıktaki ortamlarda yağ asidi oksidasyon ve ayrışma oranını artırarak ısı üretim ihtiyaçlarını karşılarken, mitokondriyal yağ asidi oksidasyon oranındaki artışa reaktif oksijen türlerinin (ROS) hızlandırılmış üretimi eşlik eder. Önceki çalışmalar, düşük sıcaklıklara akut veya uzun süreli maruz kalmanın farelerde istirahat metabolizma hızını ve iskelet kası ROS seviyelerini artırdığını göstermiştir. ROS seviyelerindeki artış iskelet kası proteinlerinde, nükleik asitlerde ve lipitlerde oksidatif hasara neden olarak motor performansı ve iskelet kasının iyileşmesini etkileyebilir. Bu nedenle, düşük sıcaklıktaki ortamlarda iskelet kasları tarafından üretilen büyük miktarda ROS'un zamanında uzaklaştırılması ve antioksidan kapasitelerinin iyileştirilmesi, normal fizyolojik işlevlerinin sürdürülmesi için çok önemlidir.
Nükleer faktör E2 ile ilişkili faktör 2'nin (Nrf2) aracılık ettiği antioksidan savunma sistemi, hücresel redoks homeostazının korunmasında çok önemli bir rol oynar. Hücreler oksidatif stres altındayken, sitoplazmadaki Nrf2, negatif düzenleyici proteini Kelch like cyclooxygenase related protein-1 (Keap1) tarafından ubikitine edilmez veya bozulmaz. Çekirdeğe girer ve çok sayıda gen promotöründeki antioksidan yanıt elementlerine (ARE) bağlanır, çoğu antioksidan enzimin ve faz II detoksifiye edici enzimin ekspresyonunu yukarı doğru düzenler ve vücuttaki oksidatif strese karşı koruyucu bir etki gösterir. Bununla birlikte, çalışmalar düşük sıcaklıklara akut veya uzun süreli maruz kalmanın fare kalp, karaciğer ve akciğer doku ve organlarında Nrf2 mRNA ve protein ekspresyonunu önemli ölçüde azalttığını bulmuştur, bu da düşük sıcaklıklı ortamların doku ve organlarda Nrf2 ekspresyonunu inhibe edebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, akut hipotermiye maruz kalmanın iskelet kasında Nrf2 ekspresyonunu ve antioksidan kapasiteyi de inhibe edip etmediğine dair yurtiçi ve yurtdışında herhangi bir rapor bulunmamaktadır.

Sülforafan (SFN) turpgillerden bitkilerde bol miktarda bulunur ve Nrf2'nin spesifik bir aktivatörü olarak kabul edilir. Bu nedenle, bu çalışmada öncelikle 1 saat ve 3 saat gibi farklı sürelerde akut hipotermiye maruz kalmanın fare iskelet kasında Nrf2 ve antioksidan enzimlerin ifadesinin yanı sıra antioksidan kapasite üzerindeki etkileri gözlemlenmeye çalışılmıştır; Ayrıca, buna dayanarak, düşük sıcaklığa maruz kalmadan önce SFN uygulamasının iskelet kasındaki Nrf2 aracılı antioksidan enzim sistemi ve glutatyon redoks homeostazı üzerindeki etkileri daha fazla araştırılmıştır. Bu çalışma, SFN'nin düşük sıcaklıklı ortamlarda bir sporcu besin takviyesi olarak kullanılma olasılığını araştırmak için ön deneysel kanıt sağlayacaktır.

Nrf2, iskelet kasının redoks homeostazını koruyan temel bir düzenleyici faktördür. Önceki çalışmalar, düşük sıcaklığa maruz kalmanın kalp, karaciğer ve akciğer gibi doku ve organlarda Nrf2 ekspresyonunu inhibe ettiğini ve bu organlarda temizlenemeyen büyük miktarda ROS üretimine yol açtığını bildirmiştir. Bununla birlikte, akut hipotermiye maruz kalmanın iskelet kasındaki Nrf2 ekspresyonu ve antioksidan kapasite üzerindeki etkileri hakkında herhangi bir rapor bulunmamaktadır. Bu nedenle, bu çalışmada ilk olarak 1 ve 3 saatlik düşük sıcaklığa maruz kalmanın iskelet kasındaki Nrf2 aracılı antioksidan sistem üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Sonuçlar, 3 saat düşük sıcaklığa maruz kalan farelerin iskelet kasındaki Nrf2 mRNA transkripsiyon seviyesinin önemli ölçüde azaldığını, ROS seviyesinin ise önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Daha sonraki deneysel sonuçlar da PBS+Soğuk grubundaki farelerin iskelet kasındaki Nrf2 proteininin ifadesinin PBS+Soğuk grubuna kıyasla azalma eğilimi gösterdiğini ve T-AOC seviyesinin önemli ölçüde azaldığını, ROS seviyesinin ise artma eğilimi gösterdiğini ortaya koymuştur. 3 saatlik düşük sıcaklığa maruz kalmanın fare iskelet kasında Nrf2 ekspresyonunu inhibe edebileceği ve antioksidan kapasitesini azaltabileceği tahmin edilmektedir.

Düşük sıcaklığa 3 saat boyunca maruz kalmak iskelet kasının antioksidan kapasitesini azaltır, bu da Nrf2 aracılı antioksidan enzim ekspresyonunun ve glutatyon redoks homeostazının inhibisyonu ile ilişkili olabilir. Önceki çalışmalar, 3 saatlik akut hipotermiye maruz kalmanın fare böbreklerinde, akciğer dokularında ve kahverengi yağ dokusunda SOD1 ekspresyonunu önemli ölçüde azaltabileceğini bildirmiştir. Aralıklı düşük sıcaklığa maruz kalma (3 gün boyunca günde 8 saat) sıçan akciğer dokusunda GPX1 aktivitesini ve HMOX1 protein ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmıştır. Uzun süreli düşük sıcaklığa maruz kalma (günde 4 saat, haftada 6 gün, toplam 2 hafta) fare beyin dokusunda SOD1 aktivitesini ve CAT protein ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmıştır. Bu çalışma, 0 ve 1 saatlik gruplarla karşılaştırıldığında, 3 saatlik gruptaki farelerin iskelet kasındaki antioksidan enzim genlerinin (Gpx1, Hmox1, Cat, Sod1, Nqo1) mRNA transkripsiyon seviyelerinin önemli ölçüde azaldığını bulmuştur. Sonraki deneysel sonuçlar da PBS+Soğuk grubundaki farelerin iskelet kasındaki antioksidan enzim genlerinin (Gpx1, Hmox1, Cat, Sod1, Nqo1) mRNA transkripsiyon seviyelerinin PBS+Soğuk grubu ile karşılaştırıldığında azalma eğilimi gösterdiğini ve HMOX1 ve CAT proteinlerinin ekspresyonunun önemli ölçüde azaldığını göstermiştir. Buradan, 3 saatlik düşük sıcaklığa maruz kalmanın Nrf2 aracılı antioksidan enzimlerin transkripsiyonunu ve translasyonunu inhibe edebileceği, dolayısıyla iskelet kasının antioksidan kapasitesini etkileyebileceği sonucu çıkarılabilir. Buna ek olarak, çalışmalar akut düşük sıcaklığa maruz kalmanın insan kırmızı kan hücrelerinde GSSG içeriğini ve GSH/GSSG oranını azaltabileceğini, ayrıca sıçan karaciğeri ve mide dokularında GSH içeriğini azaltabileceğini göstermiştir. Bu çalışmanın sonuçları, PBS+Con grubuyla karşılaştırıldığında, PBS+Soğuk grubundaki farelerin iskelet kası GSSG içeriğinin ve GSH/GSSG oranının sırasıyla önemli ölçüde arttığını ve azaldığını, GSH içeriğinin ise önemli ölçüde değişmediğini göstermiştir. Bu durum GSSG birikiminin GSH/GSSG oranındaki düşüşün ana nedeni olabileceğini göstermektedir.

SFN'nin Nrf2 üzerindeki spesifik aktivasyon etkisi geniş çapta doğrulanmıştır. Bir çalışmada, 12 haftalık SFN diyet müdahalesinin yaşlı farelerin ekstansör digitorum longus kasında Nrf2 tarafından düzenlenen antioksidan enzim sistemini aktive ettiği, kas gücünü ve egzersiz dayanıklılığını artırdığı bulunmuştur. Buna ek olarak, sıçanlara tükenme egzersizinden üç gün önce intraperitoneal olarak SFN enjekte edilmiş, bu da plazma laktat dehidrojenaz ve kreatin fosfokinaz aktivitesinde azalmanın yanı sıra lateral uyluk kasında Nrf2 ve antioksidan enzim (NQO1, GST, GSR) protein ekspresyonu ve aktivitesinde artışa neden olmuştur. Egzersizden tükenmeye kadar geçen süre ve mesafe de artmıştır. Yukarıdaki araştırma sonuçları, Nrf2'nin SFN aktivasyonunun, aracılı antioksidan kapasitesini ve egzersiz dayanıklılığını artırmada önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu nedenle, 3 saatlik düşük sıcaklığa maruz kalma sırasında iskelet kası antioksidan kapasitesindeki azalmayı iyileştirmek için, 3 saatlik düşük sıcaklığa maruz kalmadan önce farelere SFN takviyesi yaptık. Deneysel sonuçlar, PBS+Soğuk grubu ile karşılaştırıldığında, SFN+Soğuk grubu farelerin iskelet kası Nrf2 mRNA ve protein ekspresyonunun yanı sıra T-AOC'de önemli bir artış ve ROS seviyelerinde önemli bir düşüş gösterdiğini ortaya koymuştur. Hatırlatma: Nrf2'nin SFN aktivasyonu, 3 saat boyunca düşük sıcaklığa maruz kalan iskelet kasının T-AOC'sini artırabilir, aşırı ROS'u ortadan kaldırabilir ve iskelet kasının redoks homeostazını korumada olumlu bir etkiye sahip olabilir.

SFN takviyesi, düşük sıcaklıklara maruz kalan farelerde iskelet kasının antioksidan kapasitesini artırır, bu da Nrf2 aracılı antioksidan enzim sisteminin SFN tarafından etkinleştirilmesiyle yakından ilişkilidir. Nrf2 tarafından düzenlenen endojen antioksidan enzimler, ROS temizliğinin ana yürütücüleridir. Örneğin, SOD1 oksijen ve hidrojen peroksit üretmek için süperoksit anyon radikallerinin parçalanmasını katalize eder; CAT hidrojen peroksiti su ve oksijene parçalayabilir; GPX1, GSH'yi bir substrat olarak kullanarak hidrojen peroksit veya organik peroksitlerden su ve ilgili alkollerin oluşumunu katalize eder; NQO1, hidrokinon oluşturmak için kinonun çift elektron indirgeme reaksiyonunu katalize eder, kinon atılımını teşvik eder ve kinonun tek elektron indirgeme reaksiyonu yoluyla ROS üretmesini önler; HMOX1, antioksidan hasar işlevlerine sahip biliverdin, CO ve demir iyonları üretmek için toksik serbest hemoglobinin ayrışmasını katalize eder. Bu çalışmanın sonuçları, SFN'nin 3 saatlik düşük sıcaklığa maruz kalmadan önce uygulanmasının, PBS+Soğuk gruba kıyasla SFN+Soğuk grup farelerde iskelet kası antioksidan enzim genlerinin (Gpx1, Hmox1, Cat, Sod1, Nqo1) mRNA transkripsiyon seviyelerini ve HMOX1 ve SOD1'in protein ekspresyonunu önemli ölçüde artırdığını göstermiştir. Yukarıdaki sonuçlar, SFN'nin Nrf2 aktivasyonunun bu antioksidan enzim genlerinin transkripsiyonunu ve translasyonunu arttırdığını göstermektedir.

Buna ek olarak, SFN takviyesi düşük sıcaklıklara maruz kalan farelerde iskelet kasının antioksidan kapasitesini artırır. Antioksidan enzimlerin artan ifadesine ek olarak, Nrf2 aracılı glutatyon redoks sisteminin SFN aktivasyonu ile de yakından ilişkilidir. Glutatyon, glutamik asit, sistein ve glisinden oluşan bir tripeptittir ve organizmaların antioksidan savunma sisteminde önemli bir küçük moleküllü aktif oligopeptittir. Glutatyon esas olarak hücrelerde GSH formunda bulunur. Molekülündeki sisteinin aktif tiyol grubu ROS'a elektron sağlayabilir ve daha sonra GSH, ROS'un sürekli olarak elektron kapmasını önlemek için kararlı bir dimer GSSG'ye dönüştürülür, böylece proteinleri, lipitleri ve nükleik asitleri oksidatif hasardan korur ve hücrelerin redoks homeostazını korur. Vücutta GSH üretimi temel olarak iki yolla gerçekleşir: sentez ve indirgeme. İlk olarak, glutamik asit ve sistein, glutamilsistein oluşturmak için GCLC ve GCLM tarafından katalize edilir, ardından glutamilsistein ve glisin GSH oluşturmak için GSS tarafından katalize edilir; İkinci olarak, GSSG, NADPH ve GSR'nin etkisi altında GSH'ye indirgenebilir. Bu nedenle, Gclc, Gclm, Gss ve Gsr, GSH üretimini düzenleyen anahtar enzim genleridir ve Nrf2'nin aşağı akış hedef genleridir. SFN takviyesinden sonra, SFN+Soğuk grup farelerin iskelet kasındaki glutatyon sentaz genleri Gclm, Gss ve Gsr'nin mRNA transkripsiyon seviyelerinin PBS+Soğuk gruba kıyasla önemli ölçüde arttığını ve GSH ve GSSG içeriklerinin önemli ölçüde azaldığını bulduk. Bunun akut düşük sıcaklık stresi olabileceği ve SFN takviyesinin GSH'nin de novo sentezini ve indirgeme yollarını artırabileceği tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, GSH, akut düşük sıcaklığa maruz kalmanın neden olduğu büyük miktarda ROS üretiminin ortadan kaldırılmasında önemli bir rol oynar ve sonuçta önemli miktarda GSH tüketimine yol açar. Vücudun redoks dengesini değerlendirmenin temel göstergesi olan GSH/GSSG oranına bakıldığında, SFN+Soğuk grubunda GSH/GSSG oranının önemli ölçüde arttığı görülebilir.

Genel olarak, bu çalışma 3 saatlik akut hipotermiye maruz kalmanın Nrf2 aracılı antioksidan aktiviteyi engellediğini göstermektedir. Düşük sıcaklıklara maruz kalmadan önce, sülforafan uygulaması Nrf2 aracılı antioksidan enzimleri ve glutatyon antioksidan sistemlerini aktive ederek iskelet kası antioksidan kapasitesini artırmıştır.