İskemik serebrovasküler hastalık iki tür içerir: geçici iskemik inme ve serebral enfarktüs. Bunlar arasında serebral enfarktüs, geleneksel Çin tıbbı teşhisinde iskemik inme (IS) olarak adlandırılır ve beyin dokusu bölgelerinde lokal kanlanma bozukluklarına yol açan çeşitli nedenlerden kaynaklanan, iskemik ve hipoksik lezyonlar ve beyin dokusunun nekrozu ile sonuçlanan ve daha sonra bir dizi nörolojik fonksiyon bozukluğu üreten bir hastalıktır. Yüksek ölüm ve sakatlık oranlarının yanı sıra karmaşık patolojik mekanizmaları, her yıl dünyaya önemli bir ekonomik yük getirmektedir. Beyin hücrelerinde oksijen glukoz yoksunluğu (OGD), temel ve klinik öncesi inme araştırmalarında yaygın olarak kullanılan en yaygın in vitro iskemik inme modelidir.
Otofaji, ökaryotik hücrelerde yaygın olarak bulunur ve hücre sağkalım ve ölüm süreçlerinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Çok sayıda çalışma, otofajinin iskemik beyin hasarının oluşumu ve gelişimi ile yakından ilişkili olduğunu göstermektedir. Bazı çalışmalar nöronal otofajinin iskemik beyin hasarını hafifletebileceğini gösterirken, diğerleri nöronal otofajinin iskemik beyin hasarını şiddetlendirebileceğini bildirmiştir, ancak spesifik mekanizma hala belirsizdir.
β - nikotinamid mononükleotid (NMN) çeşitli gıdalarda bulunur ve hücresel yaşlanmanın düzenlenmesi ve normal vücut fonksiyonlarının sürdürülmesi için çok önemlidir. Birçok önemli hücre içi sinyal yolunun iletimine katılır. NMN'nin in vitro olarak uygulanmasının, hücre yaşlanmasını düzenlemek ve normal vücut fonksiyonlarını sürdürmek için onu hızla NAD + 'ya dönüştürebileceğine dair araştırma raporları vardır. NMN, IS'nin neden olduğu NAD+ azalmasını telafi edebilir ve serebral iskemide nöronal hasarı iyileştirebilir. Bu, NMN'nin IS'de belirli bir rol oynadığını göstermektedir. Çalışmalar, NMN'nin nörovasküler rejenerasyonu teşvik edebileceğini, beyin mikrovasküler endotel fonksiyonunu, anti-inflamatuar ve anti apoptotik etkileri iyileştirebileceğini göstermiştir. NMN'nin otofajiyi düzenleyerek anti iskemik beyin hasarı etkileri gösterebileceğini öne süren birkaç çalışma da vardır, ancak NMN'nin otofajiyi ve anti IS'yi düzenlediği spesifik mekanizma henüz net değildir.
Bu çalışmanın amacı oksijen glukoz yoksunluğu PC12 hücre modeli oluşturmaktır. Hücre sağkalım oranı in vitro MTT testi ile ölçülmüş, otofagozomlar ve otolizozomlar transmisyon elektron mikroskobu ile tespit edilmiş, otofagozom floresan yoğunluğu MDC ile gözlenmiş ve LC3-II/LC3-I, Beclin1, p62 ve P-mTOR/mTOR'un otofaji ile ilişkili protein ekspresyonu Western blot ile tespit edilmiştir. Amaç, NMN'nin PC12 hücrelerinde OGD ile indüklenen otofajik hasar üzerindeki etkisini açıklığa kavuşturmaktır.

2017 Lancet çalışması, inmenin hızlı hastalık ilerlemesi, yüksek ölüm ve sakatlık oranları ile Çin'de yıllarca yaşam kaybına neden olan ana hastalık olduğunu göstermiştir. Bunlar arasında IS, tüm inmelerin 60% ila 70%'sini oluşturmaktadır ve beynin belirli bir bölgesine kan akışının azalmasına yol açan vasküler tıkanıklıktan kaynaklanmaktadır. Serebral iskemi ve hipoksiden sonra, otofaji, apoptoz, oksidatif stres ve hücre içi kalsiyum aşırı yüklenmesi gibi bir dizi patolojik ve fizyolojik reaksiyonu tetikleyebilir. İD'den kurtulanların uzun iyileşme döngüsü küresel ekonomik yükü artırmıştır. Günümüzde, İD'nin önlenmesi ve tedavisi için piyasada kullanılan ilaçlar için birçok kontrendikasyon bulunmaktadır. Bu nedenle, İS'nin önlenmesi ve tedavisine yönelik ilaçların sürekli olarak araştırılması gerekmektedir. OGD, IS'yi in vitro olarak incelemek için klasik bir modeldir. PC12 hücre hattı, iskemi ve hipoksi hasarı araştırmalarında yaygın olarak kullanılan nöronal hasarı incelemek için en yaygın kullanılan hücre hatlarından biridir. Bu nedenle, bu deneyde in vitro araştırma için OGD PC12 hücre modeli kullanılmıştır.
NMN, insan vücudunda doğal olarak bulunan ve birçok gıdada da bulunan 334,22 molekül ağırlığına sahip bir maddedir. Nikotinamid fosforibosiltransferaz reaksiyonunun bir ürünüdür ve aynı zamanda NAD+'nin temel öncülerinden biridir. Çalışmalar, organizmalardaki NMN seviyelerini düzenlemenin kardiyovasküler ve serebrovasküler hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar ve yaşa bağlı dejeneratif hastalıklar üzerinde iyi terapötik ve onarıcı etkilere sahip olduğunu bulmuştur. NMN uygulamasının sıçan MCAO modellerinde enfarktüs boyutunu ve nörolojik hasarı azaltabileceğine dair araştırma raporları da bulunmaktadır. Bu deneyde, OGD'nin PC12 hücrelerinin hayatta kalma oranını azaltabileceğini göstermek için MTT deneyi kullanılmıştır. NMN, OGD PC12 hücrelerinin hayatta kalma oranını 400, 800 ve 1600 μ mol/L konsantrasyonlarda artırabilir ve en yüksek hayatta kalma oranı 800 μ mol/L konsantrasyonda gözlenmiştir; Bununla birlikte, NMN200 ve 3200 μ mol/L konsantrasyonları arasında hücre hayatta kalma oranında önemli bir fark yoktu, bu da 200 μ mol/L konsantrasyonun OGD kaynaklı PC12 hücre hayatta kalma oranını iyileştirmek için henüz etkili konsantrasyona ulaşmadığını gösterirken, 3200 μ mol/L konsantrasyonu aşırı konsantrasyon nedeniyle hücrelerde belirli hasara neden olmuş olabilir.
Tip II programlı hücre ölümü olarak da bilinen otofaji, hücrelerin otofaji ile ilgili genlerin düzenlemesi altında, hayatta kalmalarını, farklılaşmalarını, büyümelerini ve stabilitelerini korumak için hasarlı, denatüre veya yaşlanan makromolekülleri ve organelleri bozmak için lizozomları kullandıkları süreci ifade eder. Araştırmalar otofajinin IS'den sonra indüklendiğini ve IS'nin patolojik süreciyle birlikte otofajinin de ortaya çıktığını ve geliştiğini, IS'nin akut, subakut, iyileşme ve sekel aşamalarında farklı düzenleyici roller oynadığını göstermektedir.
MTOR, 289 kDa nispi moleküler ağırlığa sahip atipik bir serin/treonin protein kinazdır. Farklı proteinlerin bağlanmasıyla mTORCl ve mTORC2 olmak üzere iki farklı kompleks oluşturabilir. MTORCl rapamisine duyarlıdır ve esas olarak hücresel otofaji, ribozom biyogenezi, protein translasyonu ve lipid sentezini düzenleyen büyüme faktörleri ve besin sinyallerinin entegrasyonundan sorumludur. MTORT, otofaji için bir valf olarak kabul edilir. Araştırmalar, fosforile mTOR'un oksidatif glikoz yoksunluğu hasarını hafifletebileceğini ve hücrelerde koruyucu bir rol oynayabileceğini göstermiştir. 3-MA yaygın olarak kullanılan bir otofaji inhibitörüdür. RAPA, otofaji aktivatörü olarak da bilinen mTORC1'i inhibe ederek otofajiyi indükleyebilen bir mTOR inhibitörüdür. Bu deney, PC12 hücrelerinde OGD ile indüklenen otofajiye müdahale etmek ve düzenlemek için 3-MA ve RAPA gruplarını kurdu; Aynı zamanda, NMN'nin PC12 hücrelerinde OGD ile indüklenen otofaji üzerinde 3-MA veya RAPA'nın etkilerine karşı koyup koyamayacağını gözlemlemek için 3-MA, RAPA ve ilaç kombinasyon grupları da kuruldu.
Beclin-1, LC3 ve p62 proteinlerinin seviyeleri, otofaji için önemli tespit göstergeleri olarak hizmet edebilir. Beclin1, otofaji ile pozitif korelasyon gösteren olgun bir otofaji düzenleyicisidir. Beclin1, otofaji ve membran taşıma işlevlerini yerine getirmek için VPS15, VPS34, ATG14 gibi proteinlerle etkileşime girer. LC3, mayada otofajide rol oynadığına inanılan ubikitin benzeri değiştirici ATG8'in bir homologudur. ATG4 ile muameleden sonra LC3, C-terminal kalıntısını kaybeder ve LC3-I'e dönüşür. LC3-I, otofagozom membranındaki lipid molekülü fosfatidiletanolamine kovalent olarak bağlanarak LC3-II'ye dönüşen enzimatik reaksiyonlar gibi bir dizi ubikitinasyona uğrar. LC3-II/LC3-I oranındaki artış, otofaji seviyelerinde bir artış olduğunu gösterir. P62, otofaji aktivitesini yansıtan bir marker proteindir ve protein seviyesi otofaji ile negatif korelasyon gösterir. Yani, otofaji gerçekleştiğinde, p62 proteini sitoplazmada sürekli olarak bozulur; otofaji aktivitesi zayıfladığında ve otofaji işlevi bozulduğunda, p62 proteini sitoplazmada sürekli olarak birikecektir. Bu deney, Western blot teknolojisi aracılığıyla NMN'nin Beclin1 ve LC3-II/LC3-I proteinlerinin göreceli ekspresyon seviyelerini aşağı çekebileceğini ve P-mTOR/mTOR ve p62 proteinlerinin ekspresyon seviyelerini yukarı çekebileceğini doğrulamıştır. Ayrıca, NMN'nin OGD PC12 hücrelerinde otofagozom ve otolizozom sayısını ve yoğunluğunu azaltabildiğini doğrulamak için transmisyon elektron mikroskopisi ve MDC yöntemi kullanılmıştır. Yukarıdakiler, NMN'nin PC12 hücrelerinde OGD ile indüklenen otofajiyi inhibe edebileceğini göstermektedir.
Özetle, belirli bir NMN dozunun PC12 hücrelerinde OGD kaynaklı otofajik hasara karşı koyabileceğini ve böylece hücresel koruyucu bir etki uygulayabileceğini ve bu koruyucu etkinin mTOR ile ilgili yolaklarla ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Bu çalışma, OGD kaynaklı otofajik hasarın NMN tarafından önlenmesi ve tedavisi için belirli bir hedef referansı sağlayabilir ve doğal bileşik NMN'nin geliştirilmesi için laboratuvar verilerini biriktirebilir.