Исследование метода высокопроизводительного обнаружения эрготионеина лингжи
Эрготионеин (ЭГТ), также известный как 2-тио-Лгистидин триметил внутренняя соль, - это природная аминокислота, которая в изобилии содержится во многих животных и растениях. Она синтезируется только в некоторых микроорганизмах (актиномицеты, стрептомицеты), грибах и некоторых цианобактериях, и не может быть синтезирована самими животными организмами. Человеческий организм может получать EGT только из пищи и накапливать его в высоких концентрациях в различных клетках и тканях с помощью высокоспецифичного транспортера органических катионов novel type-1 (OCTN1). EGT считается сильным антиоксидантом, и Servillo et al. исследовали механизм его антиоксидантного действия, полагая, что он обладает уникальным окислительно-восстановительным механизмом, и предложили уникальный антиоксидантный эффект EGT в клетках. Стандартный окислительно-восстановительный потенциал EGT составляет -0,06 В, в то время как потенциал других тиолов обычно находится в пределах от -0,32 до -0,2 В. Поэтому EGT более стабилен, чем другие антиоксиданты, в физиологических условиях pH и менее подвержен спонтанному окислению. Исследования показали, что EGT обладает множеством важных физиологических функций, таких как противовоспалительное действие; защита клеток за счет защиты ДНК; антидепрессивная функция за счет стимулирования дифференциации нейронов и нейрогенеза; защита глаз за счет противостояния окислительному стрессу; Функция защиты сердечно-сосудистой и цереброваскулярной системы, достигаемая путем прерывания экспрессии молекул адгезии, связанных с атеросклерозом; EGT имеет широкие перспективы применения в таких отраслях, как медицина, пищевая промышленность и косметика, благодаря его профилактическому и терапевтическому воздействию на нейродегенеративные заболевания, достигаемому путем подавления токсичности, и присущей ему безопасности.

Методы производства ЭГТ включают химический синтез, экстракцию съедобных грибов и микробную ферментацию. Из-за высокой стоимости и сложного процесса первых двух методов, глубокая ферментация гиф съедобных грибов в настоящее время является основным способом промышленного производства ЭГТ. Однако природные штаммы имеют низкий уровень производства ЭГТ, поэтому необходимо выращивать высокопродуктивные промышленные штаммы ЭГТ с помощью методов селекции. Методы культивирования промышленных штаммов съедобных грибов включают в себя селекцию с помощью мутагенеза, гибридизацию, генную инженерию и селекцию с помощью слияния протопластов. Однако каждый метод селекции требует проведения многочисленных крупномасштабных тестов на содержание EGT. Следует отметить, что тестирование содержания EGT в процессе селекции имеет большее значение для сравнения содержания между образцами. В настоящее время методы определения EGT включают высокоэффективную жидкостную хроматографию, высокоэффективный капиллярный электрофорез и тонкослойный электрофорез. Наиболее широко используется высокоэффективная жидкостная хроматография, которая позволяет точно определять содержание EGT в сложных материальных системах. Однако высокоэффективная жидкостная хроматография имеет свои очевидные недостатки, а именно: она требует изучения различных условий обнаружения для разных образцов. Кроме того, из-за позднего времени пика ЭГТ и дороговизны стандартных образцов отбор высокопродуктивных проб из большого количества образцов при разведении может привести к длительному времени обнаружения и высокой стоимости, что значительно затрудняет развитие и применение исследований ЭГТ. Поэтому необходимо разработать высокопроизводительный метод быстрого обнаружения, позволяющий точно определять концентрацию EGT между образцами.
Благодаря своим сильным антиоксидантным свойствам и умеренной восстанавливаемости до ионов двухвалентного железа (не подвержен влиянию контакта с кислородом воздуха и не восстанавливается из-за слабой восстанавливаемости), EGT может реагировать с ионами двухвалентного железа, образуя бесцветные хелаты, в то время как тиоцианат-ионы реагируют с ионами двухвалентного железа, образуя красные комплексы. Исходя из этих характеристик, тиоцианат железа был выбран в качестве восстановителя в данном исследовании, а стандарт эрготамина был использован для реакции с тиоцианатом железа, чтобы создать высокопроизводительную систему обнаружения эрготамина. В то же время система высокопроизводительного обнаружения была проверена путем изменения выхода ЭГТ из различных штаммов Ganoderma lucidum. Результаты этого исследования позволят разработать новые методы и идеи для скрининга высокопродуктивных микроорганизмов ЭГТ и выведения новых высокопродуктивных штаммов ЭГТ.

Основываясь на сильных восстановительных физико-химических свойствах эрготионеина, перед созданием тиоцианатной системы железа EGT были проведены эксперименты по созданию щелочной системы перманганата калия, системы бромокрезолового зеленого, системы метиленового синего в синей бутылке, системы гваякола и системы хлорида железа EGT. Результаты показали, что система щелочного перманганата калия не работает из-за низкой стабильности; развитие цвета системы бромокрезолового зеленого не работает из-за зависимости от рН; в системе метиленового синего из синей бутылки, из-за сильной восстанавливаемости восстановленного состояния метиленового синего, он также легко окисляется до метиленового синего при контакте с кислородом воздуха, что приводит к неудаче эксперимента без каких-либо явлений; система гваякола также не работает из-за сильной восстанавливаемости и помех от контакта с кислородом; система хлористого железа не работает из-за низкой цветопередачи. Тиоцианатная система железа EGT может быть использована для изучения высокопроизводительных методов обнаружения EGT.

При разработке системы обнаружения тиоцианатного железа EGT было обнаружено, что остаточные фенольные вещества в экстракционном растворе влияют на цветную реакцию системы и снижают ее чувствительность, когда исследуемый образец извлекается обычным методом неочищенной экстракции EGT, а именно спиртовой экстракцией с продувкой азотом постоянного объема. Поэтому после экстракции постоянным объемом с продувкой азотом к раствору для экстракции необходимо добавить этап удаления фенола хлороформом.
Ganoderma lucidum - традиционный и ценный лекарственный гриб в Китае, содержащий различные биологически активные вещества и физиологические функции. Содержание эрготионеина в нем относительно высоко среди многих съедобных грибов, но как коммерчески производимый штамм, его урожайность все еще низка. Поэтому выращивание нового штамма Ganoderma lucidum с высоким содержанием эрготионеина имеет большое значение и практическую ценность. Исходя из вышеизложенных соображений, в нашей лаборатории была получена партия продуктов псевдослияния путем регенерации слияния протопластов, их выделения и идентификации. Все продукты синтеза Ganoderma lucidum, использованные в процессе валидации данного метода, были получены из этого источника.
Метод, разработанный в данном исследовании, основан на физических и химических свойствах самого EGT, а система обнаружения чувствительна и стабильна. Он подходит для быстрого сравнения большого количества образцов в процессе селекции промышленных ферментационных штаммов, продуцирующих EGT. Теоретически, для достижения высокопроизводительного быстрого определения содержания EGT в подавляющем большинстве штаммов требуется лишь оптимизация экстракции EGT из образца, что позволяет преодолеть ограничения первоначальных исследований EGT и предоставить новые методы и идеи для общего развития и применения EGT.