Эмодин регулирует MiR-21-опосредованную аутофагию для облегчения окислительного повреждения почек у мышей с диабетической нефропатией
Диабетическая нефропатия (ДН) - наиболее распространенное серьезное вторичное гломерулярное заболевание при диабете и частая причина хронической почечной недостаточности. Избыток сахара в крови может вызвать окислительный стресс в почках, что приводит к накоплению реактивных форм кислорода (ROS) во внутренних клетках почек. Это может вызвать окислительное повреждение подоцитов, эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток канальцев и мезангиальных клеток, усугубляя возникновение и развитие диабетической нефропатии. Аутофагия - важный механизм внутренней деградации, поддерживающий стабильность внутриклеточной среды в эукариотических клетках. Она действует путем деградации лизосомальных белков, очищая поврежденные структуры или сверхэкспрессированные белки, а также участвуя в поддержании клеточного обновления и гомеостаза. Патологические и физиологические процессы ДН тесно связаны со стрессом эндоплазматического ретикулума, дисфункцией митохондрий и воспалительной реакцией. Аутофагия очищает от неправильно сформованных белков и поврежденных органелл, способствует образованию аутофагосом и слиянию аутофаги с лизосомами, а также снимает стресс эндоплазматического ретикулума и апоптоз клеток. ROS, образующиеся при окислительном стрессе, могут индуцировать аутофагию, которая способна очистить организм от свободных радикалов и облегчить повреждение тканей и клеток почек при окислительном стрессе. Аутофагия - важный механизм, способствующий выживанию клеток. Эффективное индуцирование аутофагии и контроль воспалительного процесса являются эффективными стратегиями лечения ДН.

В последние годы исследования показали, что микроРНК (miRNA) аномально экспрессируются у пациентов с ДН и участвуют в патологических процессах, таких как агрегация мезангиального внеклеточного матрикса (ECM) и повреждение подоцитов, особенно микроРНК-21 (miR-21), которая стала актуальной темой исследований. MiR-21 широко распространена и регулирует дифференцировку, пролиферацию и апоптоз клеток. Многочисленные исследования в стране и за рубежом показали, что концентрация miR-21 в сыворотке крови пациентов с ДН значительно выше, чем у нормальных людей, а miR-21 положительно коррелирует с почечным тубулоинтерстициальным фиброзом в биоптатах почечной ткани пациентов с ДН. Таким образом, глушение miR-21 или подавление его экспрессии имеет большое значение для предотвращения долгосрочных или краткосрочных осложнений диабета. Сообщалось, что miR-21 регулирует клеточную аутофагию путем модуляции таких сигнальных путей, как Akt/mTOR и PTEN. Однако нет данных о снижении окислительного повреждения почек при диабетической нефропатии путем регуляции аутофагии, опосредованной miR-21.

Эмодин (ЭМ) является эффективным действующим веществом растений семейства Polygonaceae - Rheum palmatum L., Rheum tanguticum Maxim. ex Balf. и Rheum officinale Baill. Он относится к классу антрахиноновых соединений и обладает такими фармакологическими эффектами, как антибактериальный, противовоспалительный, иммунорегулирующий, противоопухолевый и улучшающий функцию почек. Предыдущие исследования показали, что эмодин может задерживать прогрессирование диабетической нефропатии, подавляя вызванную высоким содержанием глюкозы пролиферацию клеток гломерулярной мембраны и способствуя апоптозу мезангиальных клеток. Предварительные экспериментальные результаты также показали, что глюкоза в концентрации 25 ммоль/л может значительно способствовать экспрессии miR-21 в гломерулярных мезангиальных клетках. Цель данного исследования - изучить механизм действия эмодина на уменьшение окислительного повреждения почек у мышей с диабетической нефропатией путем регуляции аутофагии, опосредованной miR-21.

Модель диабетической нефропатии у мышей была вызвана внутрибрюшинным введением диеты с высоким содержанием сахара и жира плюс стрептозотоцина. Полученные мыши были случайным образом разделены на модельную группу, группу глимепирида (0,6 мг/кг/сут, иг), группу эмодина в высокой дозе (50 мг/кг/сут, иг), группу эмодина в низкой дозе (25 мг/кг/сут, иг) и нормальную группу (по 10 в каждой группе). Через неделю лечения в каждой экспериментальной группе мышей измеряли уровень глюкозы в крови, коэффициент массы почек и патологическую морфологию; методом флуоресцентного зонда измеряли содержание ROS в почках, а методом Elisa - содержание BUN, Cr и uAE в почках; с помощью просвечивающей электронной микроскопии наблюдали степень аутофагии в почечных клетках, а с помощью Вестерн-блота измеряли экспрессию белков P62, Atg7 и LC3. Ниже приведены репрезентативные результаты.

Окислительный стресс и апоптоз были подтверждены в тканях почек пациентов с диабетической нефропатией и на животных моделях. В экспериментах in vitro также установлено, что среда с высоким содержанием глюкозы может вызывать в подоцитах окислительный стресс, апоптоз, воспаление и другие события. Почечные подоциты играют важную роль в поддержании целостности гломерулярного фильтрационного барьера и регуляции гломерулярной проницаемости. В этом процессе аутофагия гломерулярных подоцитов тесно связана с патогенезом диабетической нефропатии. Если активность аутофагии в подоцитах изменяется, чрезмерно активируется или подавляется, это может привести к воспалительному повреждению подоцитов и нарушению фильтрационного барьера. В этом эксперименте мы также наблюдали, что аутофагия подоцитов в почках мышей DN серьезно недостаточна, а уровень ROS значительно повышен. ROS - это сигнальная молекула в митохондриях подоцитов, которая является пусковым звеном для возникновения и развития диабета и его осложнений. Снижение выработки ROS является потенциальным методом предотвращения прогрессирования ДН. После перорального введения эмодина мышам мы наблюдали значительное снижение почечной ROS и увеличение аутофагии, что привело к улучшению ряда каскадных реакций, таких как значительное снижение воспалительного патологического повреждения почек и значительное снижение уровня BUN, Cr и uAE. Таким образом, стимулирование аутофагии для очистки почек мышей от РОС, индуцированных высоким содержанием глюкозы, может быть важным механизмом улучшения состояния мышей с ДН с помощью эмодина. Между тем, мы также заметили, что Glim может значительно снизить уровни BUN, Cr и uAE у мышей с ДН. Глим - это гипогликемический препарат на основе сульфонилмочевины, который действует путем связывания с рецепторами сульфонилмочевины на поверхности бета-клеток поджелудочной железы и равномерного и медленного высвобождения в естественных условиях. В то же время Глим способен повышать чувствительность окружающих тканей к инсулину и улучшать инсулинорезистентность. Утилизация глюкозы окружающими тканями повышается, а уровень глюкозы в крови значительно снижается. После достижения нормы сахара в крови снижается выработка конечных продуктов гликирования и уменьшается повреждение почек.

Было доказано, что MiR-21, являющийся геном широкого спектра действия, положительно коррелирует с возникновением диабетической нефропатии. В предыдущей литературе, как отечественной, так и зарубежной, было показано, что miR-21 может участвовать в возникновении и развитии диабетической нефропатии, опосредуя такие сигнальные пути, как TGF - β/Smad, PTEN/Akt и MMP-S/TIMPS. Что касается аутофагии, то в литературе также имеются сообщения о том, что miR-21 может вмешиваться в сигнальный путь Akt/mTOR, подавляя аутофагию в почечных подоцитах и усугубляя патогенез диабетической нефропатии. Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование miR-21 и регулирование его нижележащих путей является эффективной стратегией для улучшения ДН. В данном исследовании также было отмечено, что экспрессия miR-21 в почках мышей с ДН была значительно повышена по сравнению с нормальной группой, что может быть связано с ослаблением аутофагии в почках мышей с ДН. Было показано, что при заболеваниях, не связанных с ДН, miR-21 также участвует в жизнедеятельности таких органов, как легочный фиброз, макрофаги и гипоксические овальные клетки, посредством негативной регуляции аутофагии. После введения эмодина экспрессия miR-21 в почках мышей с ДН была значительно снижена, а ингибирование аутофагии ослаблено. Однако, является ли эмодин прямым посредником аутофагии или регулирует miR-21 опосредованную клеточную аутофагию, необходимо подтвердить с помощью анализа предсказания целевых генов, поскольку некоторые исследователи сообщали, что эмодин может регулировать аутофагию через лизосомальный и митохондриальный пути, но связано ли это с регуляцией miR-21, требует дальнейшего изучения.

Для изучения механизмов аутофагии мы обнаружили экспрессию трех классических маркерных белков аутофагии - P62, Atg7 и LC3. Эти три белка являются ключевыми участниками аутофагосомального пути, который играет важную роль в устранении и деградации поврежденных органелл, денатурированных белков и других биомолекул, а также является важным механизмом восстановления клеток. Поэтому мы предполагаем, что усиление аутофагии и восстановление патологических и физиологических функций почек у мышей DN под действием эмодина может быть связано с аутофагосомальным путем. Результаты показали, что экспрессия белков P62, Atg7 и LC3 в почках ДН-мышей была повышена после введения эмодина, что позволяет предположить, что эмодин может действовать на лизосомный путь аутофагии в почечных подоцитах для защиты почек ДН-мышей.