Оценка качества стандартного отвара Дэнчжаньхуа на основе атласа отпечатков пальцев и теста антиоксидантной активности in vitro
Дэнчжан Хуа, также известный как Дэнчжан Сисинь, - это растение семейства Астровые (Asteraceae) под названием Erigeron breviscapus (Vant.) Hand- Mazz. Высушенное целое растение собирается весной и осенью и включено в издание Китайской фармакопеи 2020 года. Его действие направлено на улучшение циркуляции крови, разблокирование коллатералей, облегчение боли, рассеивание ветра и устранение холода. Современные фармакологические исследования показали, что Scutellaria baicalensis обладает нейропротекторным, сердечно-сосудистым и цереброваскулярным защитным, антиоксидантным, противораковым и другими фармакологическими эффектами. Онкологические, сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания тесно связаны с окислительным повреждением, вызванным избыточным количеством реактивных видов кислорода, таких как супероксидные анион-радикалы, гидроксильные радикалы и липидные радикалы в организме. Правильный прием антиоксидантов может устранить избыток свободных радикалов в организме, что благоприятно сказывается на здоровье человека, профилактике и борьбе с заболеваниями. В литературе указывается, что Lamplighter обладает превосходной антиоксидантной активностью. Химический состав Lamplighter сложен, и связь между химическим составом и активным действием дозировки пока не очень ясна. Химический отпечаток пальца традиционной китайской медицины широко используется для оценки качества китайской медицины благодаря своей способности характеризовать компоненты веществ, содержащихся в китайской медицине, что соответствует общей и нечеткой природе теории традиционной китайской медицины. Однако его применение становится все более ограниченным, поскольку он отражает только химическую информацию о традиционной китайской медицине и не может установить связь с ее терапевтическим действием. В 2020 году Центр оценки лекарственных средств Национального управления медицинских изделий выпустил "Техническое руководство по выявлению биологических эффектов традиционной китайской медицины (пробный вариант)", в котором говорится о необходимости создания методов контроля качества, связанных с активностью, для обеспечения безопасности и эффективности традиционной китайской медицины в клинических условиях. Изучение "спектрально-эффективной взаимосвязи" традиционной китайской медицины позволяет тесно связать общее характерное проявление активных ингредиентов с воздействием на многочисленные показатели и цели, а также обоснованно определить основу фармакологического вещества, что также соответствует особенностям традиционной китайской медицины.

Стандартный отвар китайской медицины - это один отвар традиционной китайской медицины, приготовленный по стандартным технологиям, используемый для стандартизированного клинического приема лекарств, обеспечивающий точность приема лекарств и последовательность измерений. Он служит в качестве стандартного эталона для измерения того, соответствуют ли частицы формулы китайской медицины клиническому отвару. Предложение о стандартном отваре служит материальным ориентиром для достижения соответствия качества лекарственных форм на основе отвара традиционной китайской медицины и создания эффективных методов оценки качества. В данной статье в качестве объекта исследования взят стандартный отвар Дяньчжаньхуа, антиоксидантный эффект которого подтвержден экспериментами in vitro по уничтожению свободных радикалов DPPH и ABTS. В то же время устанавливается его ВЭЖХ-отпечаток и определяется общее содержание флавоноидов; с помощью бивариационного корреляционного анализа выявляется значительная корреляция антиоксидантных компонентов, кластерный анализ (CA) и анализ главных компонент (PCA) проводятся для отобранных компонентов, а ортогональный частичный дискриминантный анализ наименьших квадратов (OPLS-DA) используется для выявления дифференциальных компонентов; оценивается качество антиоксидантного эффекта, чтобы обеспечить основу для контроля качества Lamplighter и его препаратов.

 

 

Свободные радикалы DPPH и ABTS часто используются в качестве индикаторов для измерения антиоксидантной активности активных ингредиентов in vitro. Метод DPPH определяет антиоксидантную способность лекарственных веществ путем связывания с веществами с одиночной парой электронов, а метод ABTS определяет антиоксидантную способность путем связывания с гидрофильными и липофильными веществами. Основными действующими веществами Scutellaria baicalensis являются флавоноиды. В данном исследовании общее содержание флавоноидов в 16 партиях стандартного отвара Scutellaria baicalensis составило 2,85-11,28 мг/мл. Антиоксидантная активность отвара in vitro оценивалась по сжиганию свободных радикалов DPPH и ABTS в качестве антиоксидантных индикаторов. Значение IC50 для DPPH составило 1,00-3,39 мг/мл, а IC50 для ABTS - 0,254-2,16 мг/мл, что указывает на то, что способность стандартного отвара Scutellaria baicalensis сжигать свободные радикалы ABTS сильнее, чем способность сжигать свободные радикалы DPPH. С помощью бивариационного корреляционного анализа Пирсона было установлено, что две антиоксидантные активности in vitro (значения IC50) значительно отрицательно коррелируют с общим содержанием флавоноидов (P<0,01), с коэффициентами корреляции -0,714 и -0,841, соответственно, что указывает на то, что чем меньше значение IC50 и выше общее содержание флавоноидов, тем сильнее антиоксидантная способность экстракта. Таким образом, содержание общих флавоноидов является одним из показателей, влияющих на антиоксидантную силу Scutellaria baicalensis, и может быть использовано в качестве индикатора для оценки антиоксидантной силы Scutellaria baicalensis.
В процессе получения спектров отпечатков пальцев были экспериментально исследованы хроматографические колонки Agilent ZORBAX-SB C18, Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 и Agilent Extend C18. На основании сравнения количества хроматографических пиков и степени разделения было установлено, что Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 имеет лучшие характеристики; Мы исследовали различные скорости потока (0,8, 1, 1,2 мл/мин) и обнаружили, что 0.Мы исследовали бинарные системы 0,1% муравьиная кислота-метанол-вода, 0,1% муравьиная кислота-ацетонитрил и 0,1% муравьиная кислота-ацетонитрил-тетрагидрофуран с различными градиентами. Было обнаружено, что эффект разделения 0,1% муравьиная кислота вода ацетонитрил тетрагидрофуран был лучше, а базовая линия была относительно стабильной; при выборе длины волны детектирования 200-400 нм результаты показали, что хроматографические пики, полученные при изменении длины волны в различные периоды времени, были множественными, а базовая линия была стабильной. В итоге было определено, что длина волны составляет 252 нм с 0 по 9 минуту и 330 нм с 9 по 60 минуту.
В последние годы в литературе, посвященной спектрам отпечатков пальцев лекарственных растений, таких как Scutellaria baicalensis, в основном использовался метод ВЭЖХ, который оценивал сходство спектров отпечатков пальцев и определял общие пики; в литературе использовались CA и PCA для распознавания химического паттерна спектров отпечатков пальцев и классификации лекарственного сырья, но не проводился глубокий анализ причин различий. На основе спектра отпечатков пальцев лекарственной травы лампиридис на начальном этапе данной статьи был создан спектр отпечатков пальцев стандартного отвара лампиридиса, сходство которого составило 0,770-0,993, и получен 21 общий пик. Восемь известных компонентов были идентифицированы с помощью эталонного вещества. В данном исследовании использовался бивариационный корреляционный анализ для отбора 10 хроматографических пиков, а именно пиков 3, 4 и 6 (хлорогеновая кислота), пиков 7, 11 и 13 (скутелларин В), пика 14 (изохлорогеновая кислота В), пика 15 (скутелларин А) и пиков 17 и 19 (изохлорогеновая кислота С), которые значительно отрицательно коррелировали со способностью поглощать свободные радикалы DPPH (то есть, чем больше площадь общего пика, тем меньше значение IC50). Коэффициенты корреляции Персона составили -0,552, -0,733, -0,626 и -0, соответственно, 665, -0,537, -0,518, -0,767, -0,754, -0,541 и -0,748, что указывает на то, что соответствующие химические вещества являются основными активными ингредиентами в поглощении радикалов DPPH. Тринадцать хроматографических пиков, включая пики 3, 4, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18 (изохлорогеновая кислота А) и 19, значительно отрицательно коррелировали с поглощением свободных радикалов ABTS. Коэффициенты корреляции Персона составили -0,594, -0,861, -0,761, -0,829, -0,645, -0,583, -0,676, -0,721, -0,740, 0,574, -0,652, -0,720, и -0,518, соответственно. Соответствующие вещества являлись основными активными ингредиентами для поглощения свободных радикалов ABTS. Антиоксидантная активность (значения IC50), определенная двумя антиоксидантными методами, значительно коррелировала с известными компонентами - хлорогеновой кислотой, скутелларином B, изохлорогеновой кислотой B, скутелларином A и хлорогеновой кислотой C, что указывает на то, что эти пять компонентов являются основными действующими веществами в антиоксидантной активности скутелларина.
В эксперименте использовались 10 общих пиков, значительно коррелирующих с DPPH и общим содержанием флавоноидов, в качестве переменных, и 13 общих пиков, значительно коррелирующих с ABTS и общим содержанием флавоноидов, в качестве переменных для CA и PCA анализа, соответственно. Образцы были разделены на две категории, а именно дикие S014 и S016, и остальные 14 партий посаженных образцов. Предполагается, что это может быть связано с такими факторами, как условия произрастания (свет, высота над уровнем моря, широта и долгота над уровнем моря и т.д.) и период сбора цветков фонариков. В то же время была создана модель оценки стандартного отвара Scutellaria baicalensis с использованием этих компонентов в качестве переменных. Ранжирование баллов для 16 партий стандартного отвара в основном соответствовало ранжированию антиоксидантной активности in vitro. На основе CA и PCA автор далее провел OPLS-DA анализ и выявил четыре основных дифференциальных компонента, связанных со сжиганием свободных радикалов DPPH: пики 11, 15 (скутелларин), 14 (изохлорогеновая кислота B) и пик 13 (скутелларин); четыре основных дифференциальных компонента, связанных с очисткой свободных радикалов ABTS: пики 11, 15, 14 и пик 8 (скутелларин). Результаты исследования показывают, что при контроле качества Scutellaria baicalensis, помимо контроля высокого содержания Scutellaria baicalensis B (т.е. байкалина), необходимо добавлять другие показатели контроля качества с сильной фармакологической активностью.
Таким образом, данное исследование сочетает в себе химический дактилоскопический анализ с оценкой биологической активности, а также изучает антиоксидантные активные ингредиенты стандартного отвара лампиридиса посредством исследования спектральной корреляции. Созданный метод прост в применении, а результаты надежны, что может послужить основой для дальнейших исследований фармакологических эффектов и оценки качества лампиридиса. В будущем можно увеличить объем выборки и использовать технологию жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии для идентификации общих пиков неизвестных компонентов в стандартном отваре, изучения их фармакологической активности и всестороннего исследования спектрально-эффективной связи нескольких фармакологических активностей, что обеспечит основу для исследования качества Scutellaria baicalensis.