Анализ потенциала дегидроабиетиновой кислоты как ингибитора сигнального пути PI3K/AKT/mTOR на основе технологии компьютерного моделирования
Сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR играет важную роль в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза и чрезмерно активирован во многих опухолевых клетках. Было установлено, что он способствует развитию лекарственной устойчивости в опухолевых клетках. Ингибирование активации этого сигнального пути может способствовать апоптозу опухолевых клеток и восстановлению их чувствительности к лекарствам. Поэтому разработка малых молекулярных ингибиторов сигнального пути PI3K/AKT/mTOR стала одной из горячих точек исследования противоопухолевых препаратов. Дегидроабиетиновая кислота (ДГК) - важный трициклический дитерпеноид натуральной смолы и один из компонентов канифоли традиционной китайской медицины. В основном ее получают путем выделения канифоли с помощью реакции диспропорционирования. Она обладает стабильными свойствами и структурой, сходной с молекулами стероидов, и широко используется в синтезе и разработке флуоресцентных реагентов и промежуточных продуктов лекарств. Дегидроабиетиновая кислота и многие ее производные проявляют отличную противоопухолевую активность. Недавние сообщения показали, что 1H-бензо [d] имидазольные производные дегидроабиетиновой кислоты оказывают ингибирующее действие на PI3K α и могут снижать экспрессию фосфорилированного AKT. Наши исследования также показали, что некоторые производные дегидроабиетиновой кислоты, модифицированные B-кольцом, могут снижать уровень экспрессии фосфорилированных PI3K, AKT и mTOR, а также уровень фосфорилирования их эффекторов S6 и 4EBP1. Хотя различные производные дегидроабиетиновой кислоты продемонстрировали определенное ингибирующее действие на белки сигнального пути PI3K/AKT/mTOR, в настоящее время неясно, обладает ли сама дегидроабиетиновая кислота соответствующей ингибирующей способностью, поэтому необходимы дальнейшие исследования.

Большинство соединений оказывают свое действие, связываясь с белковыми молекулами, и их способы связывания и способности можно проверить с помощью таких методов, как анализ белковых кристаллов и тушение флуоресценции белка. Однако эксперименты занимают много времени, а их стоимость высока. Технология молекулярного докинга - это способ использования компьютеров для проведения теоретических расчетов и прогнозирования связывания между соединениями и рецепторными белками. На основе энергии связи докинга можно определить способность связывания между соединениями и белками и провести скрининг потенциальных модуляторов белков; предварительное исследование механизмов также может быть проведено с помощью полученной конфигурации докинга и других показателей докинга. Кроме того, понимание лекарственных свойств и фармакокинетических характеристик соединений, таких как всасывание, распределение, метаболизм, выведение и токсичность в организме человека, позволяет определить, можно ли их использовать в качестве соединений-кандидатов для клинического лечения. Чтобы сократить расходы на исследования, для предварительных исследований сходства и фармакокинетики лекарств постепенно стали использоваться компьютерные программы.

Поэтому в данном исследовании использовалась технология молекулярного докинга для прогнозирования способности связывания и режима связывания дегидроабиетиновой кислоты с ключевыми белками этого пути, а также проверялось фактическое ингибирование дегидроабиетиновой кислоты с помощью иммуноблотинга белков. Кроме того, был использован сетевой сервер для моделирования свойств и фармакокинетики препарата, чтобы предварительно понять потенциал дегидроабиетиновой кислоты как ингибитора сигнального пути PI3K/AKT/mTOR и обеспечить теоретическую основу для дальнейшего развития дегидроабиетиновой кислоты.

Сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR играет важную роль в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза, а также является одной из мишеней для лечения рака. PI3K состоит в основном из каталитической субъединицы p110 и регуляторной субъединицы p85. После активации фосфорилирования он может превращать свой субстрат 3,4-фосфатидилинозитол (PIP2) в 3,4,5-трифосфат фосфатидилинозитола (PIP3). PIP3 может связываться с AKT и способствовать фосфорилированию AKT через фосфоинозитолзависимую протеинкиназу 1 (PDK1). Активированный фосфорилированием AKT может прямо или косвенно фосфорилировать mTOR, тем самым способствуя фосфорилированию нижележащих эффекторных белков 4EBP1 и S6 для регуляции внутриклеточной биохимической активности.

Данное исследование основано на непрерывном развитии противораковых производных дегидроабиетиновой кислоты в последние годы, некоторые из которых, как сообщалось, оказывают ингибирующее действие на ключевые белки сигнального пути PI3K/AKT/mTOR. Для того чтобы изучить влияние дегидроабиетиновой кислоты как сырья на сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR и создать основу для разработки противораковых производных дегидроабиетиновой кислоты. С помощью технологии молекулярного докинга были предсказаны способность и способ связывания дегидроабиетиновой кислоты с АТФ-связывающими сайтами ключевых белков PI3K, AKT и mTOR в этом пути. Ингибирующий эффект дегидроабиетиновой кислоты на этот путь был исследован с помощью белкового иммуноблотинга, а потенциал дегидроабиетиновой кислоты в качестве перорального препарата был предсказан с помощью предварительного фармакокинетического моделирования.

Результаты молекулярного докинга показали, что дегидроабиетиновая кислота обладает определенной способностью связываться с АТФ-связывающими сайтами различных ключевых белков, при этом наиболее слабо она связывается с AKT3 при минимальной энергии связывания -6,16 ккал/моль, а наиболее сильно - с AKT1 при минимальной энергии связывания -8,04 ккал/моль. Способность дегидроабиетиновой кислоты связываться с белками пути слабее, чем у исходного лиганда, являющегося высокоэффективным ингибитором, что аналогично синтезированной нами молекуле ингибитора сигнального пути PI3K/AKT/mTOR на основе дегидроабиетиновой кислоты DBDA. В местах связывания АТФ остатки взаимодействия между дегидроабиетиновой кислотой и белками в основном являются гидрофобными остатками. За исключением Lys890 из PI3K δ, другие ключевые остатки, играющие наиболее важную роль в связывании белка с лигандом, также являются гидрофобными остатками. Это указывает на то, что дегидроабиетиновая кислота может оказывать ингибирующее действие путем связывания с железистой извилиной сайтов связывания АТФ. Остатки взаимодействия между различными белками и дегидроабиетиновой кислотой значительно перекрываются с остатками исходного лиганда, что указывает на то, что дегидроабиетиновая кислота может конкурировать с АТФ аналогично исходному лиганду для ингибирования действия белков. Кроме того, структуры без водородных связей, такие как дегидроабиетиновая кислота с PI3K α, AKT2 и AKT3, имеют более высокую энергию связывания, чем другие структуры с водородными связями, что указывает на то, что водородные связи играют важную роль в стабильном связывании дегидроабиетиновой кислоты с белками. В конфигурации связывания дегидроабиетиновой кислоты все водородные связи образуются в карбоксильном положении. Однако в исходном лиганде существует множество перекрывающихся остатков вблизи изопропилового и бензольного колец, которые взаимодействуют через водородные связи. Эта особенность позволяет предположить, что при разработке новых ингибиторов сигнального пути PI3K/AKT/mTOR на основе дегидроабиетиновой кислоты можно усилить гидрофильную способность карбоксильного положения и ввести гидрофильные группы в положения изопропильного и бензольного колец, что может улучшить связывающую способность нового соединения с белками.

Эксперименты по белковому иммуноблотингу показали, что после обработки дегидроабиетиновой кислотой экспрессия регулируемой PI3K субъединицы p85 в клетках SCC9 значительно снижалась. Снижение содержания p85 может препятствовать генерации PI3K и стать одним из факторов, снижающих экспрессию фосфорилирования нижележащего белка AKT в PI3K. Общий белок AKT и mTOR не показал значительных изменений по сравнению с холостой группой при различных концентрациях дегидроабиетиновой кислоты, но экспрессия фосфорилированных белков была значительно снижена, что указывает на ингибирование процесса фосфорилирования AKT и mTOR. Снижение экспрессии фосфорилирования 4EBP1 ниже по течению от mTOR может быть связано с тем, что 4EBP1 также может быть активирован через сигнальный путь MEK/Erk. Экспрессия фосфорилирования другого эффекторного белка S6K1, регулируемого mTOR, была значительно снижена, что может быть связано с ингибированием фосфорилирования mTOR, приводящим к снижению активации S6K1 и, таким образом, уменьшению реакции фосфорилирования S6. В целом, в клетках SCC9 экспрессия сигнального пути PI3K/AKT/mTOR ингибировалась дегидроабиетиновой кислотой, что согласуется с предсказанными результатами молекулярного докинга.

При прогнозировании свойств и фармакокинетики лекарственных средств анализ дегидроабиетиновой кислоты по правилу пяти Липински показал, что ее молекулярная масса, LogP, вращательные связи, акцепторы водородных связей и доноры водородных связей находятся в пределах диапазона, требуемого этим эмпирическим правилом. Фармакокинетический прогноз моделирует всасывание, распределение, метаболизм, выведение и токсичность дегидроабиетиновой кислоты in vivo, и дегидроабиетиновая кислота прошла большинство тестов, что указывает на ее способность оказывать лекарственное воздействие in vivo.

Таким образом, в ходе данного исследования было установлено, что дегидроабиетиновая кислота сама по себе может стать кандидатом в терапевтические агенты для ингибирования сигнального пути PI3K/AKT/mTOR с целью снижения резистентности опухолевых клеток и противоопухолевого эффекта, благодаря прогнозированию молекулярного докинга, экспериментам по иммуноблоттингу белков, тестированию лекарственного подобия и фармакокинетическому прогнозированию. В структуру дегидроабиетиновой кислоты могут быть внесены дальнейшие изменения для разработки более эффективных ингибиторов сигнального пути PI3K/AKT/mTOR на основе дегидроабиетиновой кислоты.