Полисахарид Glycyrrhiza uralensis GiP-B1 активирует макрофаги RAW264.7 через сигнальный путь TLR4/MyD88/NF - κ B
Врожденная иммунная система является важной линией защиты организма, противостоящей вторжению патогенов, и Toll-подобные рецепторы (TLR), а также антигенпрезентирующие клетки, такие как макрофаги и дендритные клетки, экспрессирующие TLR, являются важными компонентами врожденной иммунной системы. Исследования участия TLR в иммунном распознавании макрофагов, регуляции трансдукции сигнала и инициации иммунного ответа показали, что все члены семейства TLR, кроме TLR3, способны распознавать лиганды, такие как липополисахариды (LPS), связываться с фактором миелоидной дифференцировки 88 (MyD88), рекрутировать соответствующие киназы и активировать киназу ингибитора ядерного фактора каппа В (IKK), которая фосфорилирует ингибитор NF - κ B (I κ B), связывающийся с NF - κ B. И диссоциируют, активируют NF - κ B в ядро, инициируют или ингибируют транскрипцию целевых генов, тем самым регулируя врожденный иммунный ответ.
Полисахариды, являясь эффективным классом регуляторов биологического ответа, активируют иммунный ответ макрофагов через механизмы, связанные с трансдукцией сигнального пути TLRs/NF - κ B. Исследования показали, что многие растительные полисахариды могут специфически связываться с рецепторами, такими как TLR2/4 на поверхности макрофагов, активировать сигнальный путь NF - κ B, регулировать транскрипцию цитокинов и экспрессию ко-стимулирующих молекул в фагоцитирующих клетках, а также инициировать последующие каскады для активации врожденного и приобретенного иммунитета.
Glycyrrhiza inflata Bat. является характерным лекарственным растением Синьцзяна. Ее высушенные корни и корневища были включены в Китайскую фармакопею как лекарственные травы. Наша исследовательская группа подтвердила, что сырой полисахарид GiP и его очищенные компоненты способствуют пролиферации макрофагов и лимфоцитов. Очищенный компонент GiP-B1 с высоким содержанием представляет собой кислый полисахарид с основной цепью poly Rha GalA, с относительной молекулярной массой более 2,0 × 106Da и содержанием уроновой кислоты 16,8%. Он может значительно способствовать пролиферации и фагоцитозу макрофагов RAW264.7, увеличивать секрецию IL-1 β и TNF - α макрофагами, а также способствовать генерации NO и NOS. Далее исследовательская группа использовала моноклональное антитело против TLR4 для воздействия на макрофаги и обнаружила, что секреция TNF - α, IL-1 β, 1L-6 и NO, индуцированная GiP-B1, а также экспрессия мРНК iNOS, 1L-1 β, TNF - α и 1L-6 были подавлены в разной степени, что позволяет предположить, что активация макрофагов GiP-B1 может быть связана с TLR4 и его родственными сигнальными путями. Чтобы изучить связь между GiP-B1-активированными макрофагами и сигнальным путем TLR4/NF - κ B, в данном исследовании макрофаги RAW264.7 трансфицировали TLR4-интерферирующей РНК (TLR4 siRNA) in vitro, чтобы выяснить, может ли вмешательство GiP-B1 активировать макрофаги через TLR4-опосредованный NF - κ B сигнальный путь, чтобы прояснить молекулярный механизм GiP-B1-активированных макрофагов.

Макрофаги являются важными исполнителями врожденного иммунитета в организме. Являясь специализированными тканевыми фагоцитирующими клетками, они способны распознавать консервативные патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs) на поверхности патогенных микроорганизмов через рецепторы распознавания паттернов (PRRs), такие как TLRs, экспрессированные на их поверхности. Посредством нисходящих сигнальных путей они регулируют экспрессию различных генов иммунного ответа, чтобы уничтожить патогены. Исследования показали, что многие природные растительные полисахариды могут служить лигандами для TLR4, облегчая сигнализацию макрофагов через MyD88-зависимые и не зависимые пути, способствуя вхождению NF - κ B в ядро и связыванию со специфическими последовательностями распознавания на промоторах ДНК, опосредуя экспрессию цитокинов, таких как IL-1, IL-6, TNF - α и др. Эти цитокины также действуют как стимуляторы NF - κ B, дополнительно активируя NF - κ B, чтобы вызвать устойчивый воспалительный ответ и активировать адаптивные иммунные реакции.
Как растение-источник солодки традиционной китайской медицины, основные лекарственные вещества солодки набухшей включают не только хальконы с противораковой активностью, но и полисахариды с антиоксидантной, ингибирующей альфа-глюкозидазу активностью и иммунорегулирующей активностью. В ходе предварительных исследований нашей научной группы было установлено, что сырой полисахарид GiP и его очищенные компоненты Glycyrrhiza uralensis обладают эффектом стимулирования пролиферации макрофагов и лимфоцитов. Среди них очищенный компонент GiP-B1 с более высоким содержанием оказывает значительное стимулирующее действие на пролиферацию, фагоцитоз и секрецию цитокинов макрофагами RAW264.7. Предварительно исследовательская группа использовала анти-TLR4 для лечения клеток и обнаружила, что механизм его действия связан с активацией сигнального пути TLR4/NF - κ B после вмешательства образца. В данной статье используется технология siRNA для глушения гена TLR4 с помощью TLR4 siRNA, и обнаруживается, что GiP-B1 способствует пролиферации макрофагов RAW264.7 и ингибирует секрецию цитокинов TNF - α, IL-1 β и IL-6. Это указывает на то, что TLR4 участвует в воздействии GiP-B1 на пролиферацию макрофагов RAW264.7 и секрецию цитокинов, то есть активация макрофагов GiP-B1 связана с TLR4, что согласуется с результатами предыдущих экспериментов по блокаде антител. Кроме того, исходя из типов цитокинов, секретируемых макрофагами, активированными GiP-B1 через TLR4, таких как TNF - α, IL-1 β, IL-6 и т.д., можно предположить, что активация макрофагов GiP-B1 может индуцировать поляризацию в сторону M1-типа. Макрофаги типа M1 не только способствуют воспалительному ответу, но и обладают способностью к презентации антигена, что может активировать адаптивные иммунные реакции Т-клеток, индуцировать иммунные ответы Th1-клеток и выполнять функции иммунного клиренса хозяина против патогенов и опухолевых клеток. Предыдущие исследования также показали, что GiP-B1 обладает определенными противоопухолевыми эффектами in vitro. Вопрос о том, связан ли механизм действия GiP-B1 с поляризацией макрофагов и может ли он способствовать противоопухолевой иммунной функции организма, регулируя макрофаги в микроокружении опухоли, еще нуждается в дальнейшем углубленном исследовании.
Для того чтобы продемонстрировать взаимосвязь между активацией GiP-B1 макрофагов и TLR4/NF - κ B-путем, в данном эксперименте также изучались изменения экспрессии мРНК и белков регуляторных генов TLR4, зависимой молекулы MyD88, рецепторных генов NF κ Bp65, I κ B α и т.д. в макрофагах, регулируемых GiP-B1 при вмешательстве TLR4 siRNA. Результаты показали, что в результате сайленсинга гена TLR4 уровень экспрессии мРНК TLR4 снизился, содержание свободного NF - κ Bp65 в ядре значительно уменьшилось, соответственно снизилась и активация NF - κ B пути; GiP-B1 не только увеличивает экспрессию гена TLR4 в макрофагах в нормальных условиях, повышает экспрессию мРНК и белка сигнально-зависимой молекулы TLR4 MyD88 и нижележащих генов NF - κ Bp65 и p-I κ B α, но и повышает экспрессию мРНК и белка TLR4 и MyD88, NF - κ Bp65, и p-I κ B α, вызванное РНК-интерференцией, что еще раз доказывает, что GiP-B1 может действовать как один из лигандов TLR4, активировать сигнальный путь TLR4/NF - κ B, зависящий от MyD88, активировать ядерный транскрипционный фактор p65 в семействе NF - κ B, что приводит к фосфорилированной деградации I κ B и диссоциации от NF - κ B, и способствовать NF - κ B. Переносясь из цитоплазмы в ядро, связываясь со специфическими последовательностями ДНК, регулируют транскрипцию воспалительных цитокинов, клеточной пролиферации (антиапоптоз) и других генов, участвуя в воспалительных реакциях, иммунных ответах и т.д. GiP-B1 активирует макрофаги через сигнальный путь TLR4/MyD88/NF - κ B, который практически идентичен пути действия полисахаридов в вышеупомянутых исследованиях.
Таким образом, GiP-B1 может регулировать иммунную функцию макрофагов RAW264.7 через сигнальный путь TLR4/NF - κ B, а его регуляторный эффект в основном достигается через MyD88-зависимый путь. Этот эксперимент предоставляет экспериментальные доказательства активации макрофагов полисахаридами Glycyrrhiza uralensis, что помогает выяснить механизм действия полисахаридов Glycyrrhiza uralensis на воспалительную реакцию, иммунный ответ и другие аспекты.