Защитное действие олигосахаридов хитозана на мышиный колит, вызванный сульфатом декстрана
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) включают язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК). Язвенный колит был открыт Вилком и Моксоном в 1875 году, определен Боасом и Вилком в 1903 году и официально обозначен ВОЗ как особое клиническое состояние в 1905 году. Язвенный колит - это неспецифический колит, локализующийся преимущественно в сигмовидной и прямой кишке толстого кишечника. Поражения постоянно распределены в слизистой и подслизистой оболочках и медленно рецидивируют. Встречаются также случаи острого начала заболевания, проявляющиеся в основном болями в животе, диареей, липким стулом с гноем и кровью, сопровождающиеся различными внекишечными симптомами. Точная этиология и патогенез язвенного колита до сих пор неясны, считается, что он связан с различными факторами, такими как инфекция, нарушения иммунной системы, генетическая восприимчивость, окружающая среда, психическое состояние и дисбактериоз. Он очень распространен в западных странах: на каждые 105 человек приходится 10-20 страдающих им, причем в Северной Америке и Западной Европе уровень заболеваемости выше. В последние годы заболеваемость ЯК в Китае также растет. В настоящее время для лечения колита существуют симптоматические препараты, такие как 5-аминосалициловая кислота (сульфасалазин) и иммунодепрессанты, но они обладают определенными побочными эффектами, что делает поиск безопасных лекарств актуальным направлением исследований.
Хитоолигосахариды (ХОС) получают путем гидролиза хитозана (ХС), со степенью полимеризации 2-20 и средней молекулярной массой менее 3900 Da. Его молекулярная масса мала, он легко растворим в воде и может быть непосредственно поглощен биологическими организмами. Он обладает такими биологическими свойствами, как уменьшение количества жира, снижение уровня сахара в крови, подавление бактерий, борьба с раком и противовоспалительное действие, и не имеет токсичных побочных эффектов. Он может широко использоваться в различных областях, таких как медицина, косметика, пищевая промышленность и сельское хозяйство. Хитозан можно получить путем деацетилирования хитина, второго по распространенности полимера в мире после целлюлозы (обычно встречается в панцирях ракообразных, эпидермисе насекомых и клеточных стенках грибов). В настоящее время было проведено несколько исследований, посвященных влиянию олигосахаридов хитозана на колит, например, Ян и др. обнаружили, что олигосахариды хитозана могут оказывать защитное действие на колит через AMPK и NF - κ B. Однако применяемая концентрация значительно выше (обычно 500 мг/кг, что эквивалентно человеческой дозе около 3,6 г), что значительно превышает национальную рекомендуемую дозу потребления 0,5 г/день (см. объявление об утверждении шести новых пищевых ингредиентов, включая олигосахариды хитозана (2014 № 6), что эквивалентно дозе для мыши 70 мг/кг). Юсеф обнаружил, что олигосахариды хитозана в дозе 20 мг/кг также могут оказывать защитное действие на колит, используя модель колита с инфузией уксусной кислоты и эксперименты с кишечными эпителиальными клетками. Поэтому в данной статье мы используем модель колита, вызванного питьевой водой 3% DSS, чтобы проверить действие олигосахаридов хитозана на колит в различных дозах (70 и 140 мг/кг), изучить роль олигосахаридов хитозана в регулировании симптомов колита и физиологического статуса у мышей, а также предоставить данные для дальнейших исследований защитного действия олигосахаридов хитозана на колит, вызванный DSS. В этом эксперименте 50 самцов мышей C57BL/6 были случайным образом разделены на 5 групп: холостая группа, модельная группа, позитивная группа (SASP, 50 мг/кг), а также группы с низкой и высокой дозой хитозана (70 и 140 мг/кг), которым в течение 7 дней давали воду, содержащую 3% сульфат декстрана натрия (DSS) для создания модели. Оценить эффект хитоолигосахаридов по изменению веса, индексу активности заболевания, патологическому баллу и активности миелопероксидазы. Определить уровень факторов воспаления при колите с помощью ИФА.

Модель колита DSS - международно признанная и широко используемая экспериментальная животная модель ЯК, созданная в 1990 году. Ее патологические изменения включают образование язв, абсцесс крипт, воспаление мелких сосудов, уменьшение количества бокаловидных клеток и инфильтрацию различными воспалительными клетками, что сходно с клиническими симптомами колита у человека. Рекомендуемая страной доза хитозана для человека составляет 0,5 г на человека, что в пересчете на дозу для мыши составляет 70 мг/кг. Поэтому, используя эту модель, мы выбрали две дозы хитозана - 70 мг/кг и 140 мг/кг - для изучения их воздействия на DSS-индуцированный колит. В корейской литературе проводились эксперименты по изучению острой токсичности олигосахаридов, и было установлено, что LD50 олигосахаридов для мышей превышала 5,0 г/кг. Оценка безопасности функциональных продуктов из хитозана, проведенная Zhao et al., показала, что в течение 10 дней после введения мышам (1,25 г/кг/день) и крысам (1,47 г/кг/день) (примерно в 312-368 раз больше клинически рекомендуемой дозы) острых токсических реакций не наблюдалось. В этом эксперименте была создана модель язвенного колита: мышам давали свободно пить 3% DSS в течение 7 дней. На 6-й день эксперимента у мышей модельной группы наблюдались типичные физиологические симптомы колита, такие как потеря веса, потеря аппетита, неровная шерсть, диарея, липкий кал с кровью и даже ректальное кровотечение. На восьмой день вскрытия было обнаружено, что толстая кишка мышей модельной группы укорочена, а ткани толстой кишки сгущены и отечны. Окрашивание HE выявило отек слизистой оболочки толстой кишки, неполноценные эпителиальные клетки, исчезновение железистой структуры крипт и сильную воспалительную инфильтрацию. Вышеперечисленные симптомы улучшались у мышей, получавших низкую (70 мг/кг) и высокую (140 мг/кг) дозы хитозана. В соответствии с результатами Yousef et al. указал, что олигосахариды хитозана могут снижать апоптоз эпителиальных клеток кишечника, подавлять воспаление и защищать структурную и функциональную целостность эпителиального барьера кишечника. Некоторые исследования показывают, что воспалительные заболевания кишечника вызваны дефектами кишечного эпителиального барьера и дисрегуляцией иммунного ответа слизистой оболочки. Олигосахариды хитозана могут защищать эпителиальные клетки кишечника, что указывает на их важную защитную роль при энтерите. В этом эксперименте группа с дозой хитозана 70 мг/кг продемонстрировала значительные различия по сравнению с модельной группой в улучшении сокращения толстой кишки, уменьшении отека слизистой оболочки толстой кишки и защите бокаловидных клеток и крипт. Однако группа с дозой 140 мг/кг не показала значительной разницы в улучшении укорочения толстой кишки по сравнению с модельной группой, и лишь значительная разница была отмечена в улучшении показателей патологических тканей. Это указывает на то, что группа низких доз хитозана оказывает лучшее защитное действие на мышей с DSS-индуцированным колитом. Результаты показали, что доза хитозана 70 мг/кг оказывает определенное влияние на уменьшение укорочения толстой кишки и защиту структуры толстой кишки у мышей, что полезно для разработки и применения хитозана в национально рекомендуемой дозе.

В настоящее время основными направлениями лечения ИБД являются борьба с окислительным стрессом и воспалением. Считается, что окислительный стресс является патогенетической основой IBD, а избыток свободных радикалов кислорода - ключевым фактором в формировании язвенно-воспалительного повреждения тканей и колита. При выработке МДА, избытке NO образуются свободные радикалы кислорода, вызывающие окислительное повреждение и приводящие к инфильтрации большого количества воспалительных клеток в ткани. Нейтрофилы - самые быстрые иммунные клетки, которые рекрутируются в очаг воспаления на ранних стадиях ЯК. Они выполняют двойную функцию. С одной стороны, они скапливаются в эпителиальных криптах и полостях кишечника, выделяют IL-1, IL-6, MPO и т.д., высвобождая реактивные формы кислорода (ROS), вызывая дальнейшее повреждение тканей. С другой стороны, он активно поддерживает тканевый гомеостаз, выделяя противовоспалительные факторы, и может ограничивать микробную инвазию. Qiao et al. обнаружили, что олигосахариды хитозана могут снижать инфильтрацию нейтрофилов и перекисное окисление липидов в поврежденных органах в мышиных моделях сепсиса, вызванного LPS. Dou et al. обнаружили, что олигосахариды хитозана могут ингибировать выработку реактивных видов кислорода, дегрануляцию и адгезию активированных нейтрофилов у кроликов, тем самым оказывая противовоспалительное действие. Уровень миелопероксидазы (MPO) является маркером повреждения тканей и инфильтрации нейтрофилами (PMN), что может привести к разрыву слизистой оболочки и образованию язв, и тесно связан с IBD.

В эксперименте активность MPO у мышей модельной группы колита была значительно повышена по сравнению с группой холостого опыта, что указывает на значительное увеличение количества нейтрофилов в тканях кишечника и сильную инфильтрацию. После введения олигосахарида хитозана активность MPO в тканях толстой кишки снизилась, хотя и не отличалась значительно от показателей модельной группы, но наблюдалась тенденция к замедлению агрегации нейтрофилов в кишечнике и уменьшению дальнейшего повреждения тканей. Это согласуется с открытием Dou et al. о том, что олигосахариды хитозана могут способствовать апоптозу нейтрофилов и снижать высвобождение MPO у мышей с гликогеновым перитонитом. Предполагается, что это может быть связано с активацией PLD и PI3K, индуцирующей выработку нейтрофилами супероксида и других веществ.

ЯК - результат совместного действия множества факторов, среди которых важную роль играют цитокины. IL-6 может стимулировать пролиферацию Т-клеток при низких концентрациях, активировать пролиферацию В-клеток, секретировать антитела и участвовать в воспалительной реакции организма при высоких концентрациях. TNF-α, также известный как фактор некроза опухоли альфа, вырабатывается активированными макрофагами II моноцитами и способствует апоптозу. IL-6 и TNF-α, как два важных воспалительных цитокина, являются наиболее быстрыми и значительными воспалительными факторами, реагирующими на патогенные стимулы в организме. Они часто встречаются при различных патологических процессах, таких как иммунные заболевания, воспалительные реакции и опухолевый иммунитет. В слизистой оболочке толстой кишки больных ЯК экспрессия IL-6 и TNF - α значительно выше в активной фазе, чем в фазе ремиссии, они также играют важную роль в воспалении и иммунном ответе слизистой оболочки кишечника и рассматриваются как ключевые цитокины, опосредующие IBD. Ядерный фактор каппа В (NF - κ B) - важный транскрипционный фактор, связанный с экспрессией воспалительных цитокинов. При стимуляции организма I κ B может активироваться и разрушаться, активируя NF - κ B в цитоплазме и проникая в ядро, вызывая транскрипцию генов и генерируя различные воспалительные или хемокины, такие как IL-1 β, IL-6, IL-12 и TNF - α, которые еще больше усиливаются благодаря обратной связи. Юселф и др. считают, что хитоолигосахариды ослабляют воспалительные реакции в организме путем ингибирования NF - κ B пути. В этом эксперименте экспрессия IL-6 и TNF - α в тканях толстой кишки мышей с язвенным колитом была значительно увеличена, в то время как вмешательство с низкими и высокими дозами олигосахаридов хитозана могло значительно снизить уровень их экспрессии, что согласуется с результатами Yang и Youself et al. Это указывает на то, что олигосахариды могут эффективно улучшить симптомы колита путем ослабления воспалительных реакций.

При сравнении результатов эксперимента с использованием двух доз олигосахаридов хитозана было установлено, что обе дозы олигосахаридов хитозана замедляли вызванную DSS потерю веса, укорочение толстой кишки, подавляли индекс активности болезни, а также повышали активность MPO. Они значительно улучшили гистопатологические изменения и повысили уровень TNF - α и IL-6 в тканях. Среди них группа с низкой дозой и группа с высокой дозой имели лучший эффект в уменьшении длины толстой кишки и гистопатологических изменений. Это указывает на то, что группа низких доз COS обладает лучшим эффектом в облегчении симптомов колита. Юсеф и др. лечили мышей с колитом КОС в дозах 1, 5, 10, 20, 50 и 100 мг/кг и обнаружили, что 10 и 20 мг/кг КОС оказывают наилучший эффект. Подобные колоколообразные зависимости между дозой COS и эффектом наблюдались и в клетках T84, индуцированных LPS и TNF - α, что позволяет предположить, что COS может стимулировать два различных сигнальных пути, вызывать противоположные эффекты и функциональный антагонизм. Взаимосвязь между дозой и эффектом была обнаружена и в предыдущих исследованиях, проведенных в нашей лаборатории. Динг применил КОС в дозах 35, 70, 140 и 210 мг/кг к мышам с алкогольной жировой болезнью печени и обнаружил, что группы 70 и 140 мг/кг имели лучший защитный эффект. КОС в дозах 70 и 140 мг/кг, выбранные в данной статье, могут находиться в середине и в задней части формы колокола, и результаты эксперимента показывают, что группа с низкой дозой оказывает несколько лучший эффект, чем группа с высокой дозой.

Таким образом, олигосахариды хитозана могут эффективно облегчать симптомы колита, вызванного DSS. Среди них 70 мг/кг олигосахаридов хитозана более эффективны в уменьшении длины толстой кишки и гистопатологических изменений по сравнению с 140 мг/кг, и более подходят в качестве рекомендуемой дозы для использования человеком. Между тем, олигосахариды хитозана могут играть определенную роль в уменьшении воспаления и облегчении симптомов IBD за счет уменьшения инфильтрации нейтрофилов и ингибирования высвобождения провоспалительных цитокинов. Однако конкретный механизм действия хитоолигосахаридов в подавлении высвобождения воспалительных цитокинов все еще нуждается в дальнейшей проверке.