Исследование ингибирующего действия олеуропеина на тирозиназу
Тирозиназа (EC. 1.14.18.1) широко представлена в микроорганизмах, животных, растениях и человеке и является важным лимитирующим ферментом, участвующим в процессе синтеза меланина. Уровень его экспрессии и активность определяют скорость и выход синтеза меланина. Ингибирование активности тирозиназы может улучшить тирозиназный метаболизм пигментных клеток кожи, предотвратить образование пигментации, а также сыграть роль в профилактике образования веснушек, мелазмы, пигментных пятен и отбеливания. Широко используемые ингибиторы тирозиназы, такие как кверцетин и гидрохинон, обладают хорошей ингибирующей способностью, но могут вызывать побочные эффекты, такие как дерматит, кожная аллергия и даже рак кожи. Поэтому поиск безопасных, эффективных и нетоксичных ингибиторов тирозиназы в настоящее время является актуальной темой исследований. В настоящее время исследования показали, что фенолы, флавоноиды и их производные, полисахариды, летучие масла, органические кислоты, кумарины и другие соединения, содержащиеся во многих растительных экстрактах, являются хорошими источниками ингибиторов тирозиназы.
Олеуропеин - это иридоидное гликозидное соединение, образованное гидрокситирозолом и скелетом оливы, распространенное по всему оливковому дереву, с наибольшим содержанием в листьях оливы, за которыми следуют плоды оливы. В последние годы, благодаря постоянному углублению исследований олеуропеина отечественными и зарубежными учеными, было установлено, что он обладает различной биологической активностью, такой как противовирусная, противоопухолевая, антибактериальная, антиоксидантная, гипогликемическая, гипотензивная, антиальцгеймеровская, защищающая кожу от ран и т.д. Однако существует мало сообщений о влиянии олеуропеина на активность тирозиназы. Цель данной статьи - создать теоретическую основу для разработки и использования олеуропеина в качестве отбеливающего ингредиента путем изучения его влияния на активность тирозиназы и механизма действия.

В ферментативных реакциях скорость ферментативной реакции выражается путем измерения прироста продуктов в единицу времени. Под начальной скоростью понимается скорость в течение определенного периода времени в начале ферментативной реакции, при которой наклон остается практически неизменным. При определенной концентрации субстрата она определяется по наклону тангенса пересечения нуля кривой зависимости продукта от времени. Метод измерения начальной скорости ферментативной реакции обычно используется для определения активности фермента при меньшем количестве мешающих факторов. В данном эксперименте кривая времени A475nm показала приблизительно линейную зависимость от 0 до 5,3 минут реакции. По мере увеличения времени кривая постепенно сглаживалась, наклон уменьшался, и скорость реакции также снижалась. В это время измеренная активность фермента не могла отражать истинную активность фермента, поэтому скорость реакции на 5,3 минуте реакции была принята за начальную скорость.
Эксперимент по ингибированию активности тирозиназы in vitro подразделяется на эксперименты с клетками и биохимические эксперименты. Чан и др. считают, что клетки могут имитировать реальную физиологическую среду, а измерение активности тирозиназы с помощью клеточных экспериментов более надежно, чем прямое измерение активности тирозиназы, и может лучше отразить ее ингибирующую активность. В данном исследовании были обнаружены различия в ингибирующей активности олеуропеина в отношении тирозиназы клеток B16 и тирозиназы грибов. На клеточном уровне олеуропеин подавлял активность тирозиназы лучше, чем положительный контроль кверцетин. Это согласуется с результатами исследований Li et al.
Когда кожа человека подвергается воздействию ультрафиолетового излучения, в ней образуется большое количество реактивных форм кислорода (ROS) и свободных радикалов, которые ускоряют старение кожи, пигментацию и углубление морщин. Исследования показали, что повышенное количество ROS активирует тирозиназу, мобилизуя альфа-меланоцитстимулирующий гормон в эпидермисе, что в конечном итоге стимулирует меланоциты к выработке меланина. Антиоксиданты способствуют нормальному обмену веществ в организме, очищая его от реактивных форм кислорода и свободных радикалов, улучшая состояние кожи, постепенно рассеивая пигменты и, таким образом, играя отбеливающую роль. Ванг и др. обнаружили, что антиоксиданты, такие как глицирризиновая кислота, ресвератрол, окисленный ресвератрол и фенетил резорцинол, оказывают синергетический эффект между антиоксидантной активностью и ингибированием тирозиназы при использовании L-допы в качестве субстрата, значительно подавляя активность тирозиназы. Оливковый горький гликозид обладает сильной антиоксидантной активностью. Связано ли его ингибирование активности тирозиназы с антиоксидантной активностью и существует ли синергетический эффект между горьким гликозидом оливы и антиоксидантами, заслуживает дальнейшего изучения.
Тирозиназа - ключевой фермент в синтезе меланина. Ингибируя активность тирозиназы, можно подавить выработку меланина и тем самым добиться эффекта отбеливания. Результаты данного исследования показывают, что олеуропеин оказывает значительное ингибирующее действие на тирозиназу в клетках B16 и грибную тирозиназу, демонстрируя хорошую дозозависимую зависимость. Кинетический анализ показал, что тип ингибирующего действия олеуропеина на тирозиназу грибов представляет собой обратимое неконкурентное ингибирование, то есть связывание олеуропеина с тирозиназой происходит на существенной группе вне сайта связывания субстрата. Олеуропеин не снижает сродство тирозиназы к субстрату (L-допа), а скорее ингибирует активность фермента, блокируя каталитическое действие фермента, снижая Vm. Оливковый горький гликозид имеет широкий спектр источников, высокую безопасность и хорошую антиоксидантную активность. Как потенциальное сырье для отбеливающих продуктов, он имеет широкие перспективы применения.