Предварительное исследование защитного механизма нейтральных полисахаридов репы против окислительного повреждения в клетках PC12
Репа (Brassica rapa L.), также известная как чагу или маньцзин, относится к семейству Brassicaceae и роду Brassica. Она используется как лекарственное растение, корни которого богаты питательными веществами. Его можно употреблять в течение длительного времени, и он известен как "фрукт долголетия". Он обладает аппетитным и пищеварительным действием, способствует циркуляции ци, облегчает кашель и астму, способствует диурезу и детоксикации. Современные фармакологические исследования показали, что репа обладает такими фармакологическими свойствами, как снижение уровня сахара в крови, антиокислительное, антивозрастное, противоопухолевое, регулирующее иммунитет и противовоспалительное. В ходе предварительного исследования исследовательская группа определила, что содержание полисахаридов в репе составляет около 11,53%. После обезжиривания и обесцвечивающей очистки был получен водорастворимый полисахарид репы BRP. Далее из него были выделены и очищены нейтральные полисахариды из Brassica rapa L. (BRNP) и кислые полисахариды из Brassica rapa L. (BRAP), а их структуры были идентифицированы. Предварительные эксперименты показали, что полисахариды репы обладают хорошей антиоксидантной активностью, что закладывает экспериментальную основу для применения полисахаридов репы в исследованиях антиоксидантов и антистарения. Таким образом, в данном исследовании была создана модель преждевременного старения клеток PC12, индуцированного H2O2, для изучения уровней экспрессии белков Bax, Bcl-2 и каспазы-3 в клетках PC12 после повреждения, индуцированного H2O2 под действием BRNP, и дальнейшего выяснения механизма антистарения BRNP.

H2O2 - это молекула реактивных видов кислорода, которая может увеличивать содержание внутриклеточных реактивных видов кислорода и вызывать повреждение клеток. Он широко используется для получения моделей клеточного старения за короткий промежуток времени. Пролиферативная активность клеток - важный показатель, позволяющий определить, могут ли культивируемые клетки нормально пролиферировать в определенных условиях. Результаты эксперимента CCK-8 показали, что выживаемость клеток PC12 значительно снижалась при увеличении концентрации H2O2 и проявляла дозозависимый эффект. При обработке 300 мк моль/л H2O2 в течение 4 часов выживаемость клеток составляла 60,64%. В это время клетки PC12 были повреждены в определенной степени, но еще не достигли необратимого состояния. Поэтому в последующих экспериментах в качестве оптимальной концентрации и времени для окислительного повреждения клеток PC12 в течение 4 часов были выбраны 300 мкмоль/л.

Чтобы проверить, обладает ли BRNP цитотоксическим действием на клетки PC12, BRNP использовали отдельно для обработки клеток PC12 без повреждения H2O2. Результаты эксперимента показали, что после обработки различными концентрациями (7,8-2000 мк г/мл) BRNP выживаемость клеток PC12 существенно не изменилась (P>0,05), что указывает на отсутствие значительной цитотоксичности BRNP на жизнеспособность клеток PC12. При изучении влияния BRNP на H2O2-индуцированные повреждения в клетках PC12, результаты показали, что по сравнению с модельной группой, выживаемость клеток постепенно увеличивалась с увеличением концентрации BRNP (P<0,05), и выживаемость клеток значительно увеличивалась, когда концентрация BRNP достигала 250 мк г/мл. По результатам эксперимента BRNP оказывает определенное защитное действие на H2O2-индуцированные повреждения в клетках PC12.
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) существует внутри клеток и катализирует образование лактата из пирувата. При повреждении клеток ЛДГ высвобождается в больших количествах, что приводит к значительному повышению уровня внеклеточной ЛДГ. Количество высвобождаемого ЛДГ пропорционально степени повреждения, поэтому скорость утечки ЛДГ может отражать степень повреждения клеток. Результаты этого эксперимента позволяют предположить, что BRNP может предотвратить или замедлить степень повреждения клеточной мембраны и предотвратить утечку внутриклеточного LDH.
Распределение протонов по обеим сторонам внутренней мембраны митохондрий в клетке неравномерно, что формирует электрохимический градиент, известный как мембранный потенциал митохондрий. Многочисленные исследования показали, что когда какой-либо фактор, вызывающий апоптоз, стимулирует апоптоз клеток, происходит снижение мембранного потенциала митохондрий, причем это снижение мембранного потенциала происходит раньше, чем изменения в морфологии клеток. Значительное снижение мембранного потенциала митохондрий приводит к необратимому апоптозу клеток, поэтому снижение мембранного потенциала митохондрий можно рассматривать как классическое явление на ранней стадии апоптоза клеток. В настоящее время исследования подтвердили тесную взаимосвязь между митохондриальной дисфункцией и процессом старения. Так, недостаточное поступление митохондриальной энергии (ММП и АТФ) может снижать метаболические возможности организма, что приводит к ряду возрастных изменений. Среди них снижение мембранного потенциала митохондрий является одним из специфических маркеров апоптоза клеток. Результаты исследования показали, что митохондриальный мембранный потенциал клеток PC12 значительно снижается после обработки H2O2, а предварительная обработка BRNP может предотвратить снижение мембранного потенциала, вызванное H2O2.
Апоптоз - это процесс запрограммированной клеточной гибели, который включает в себя экзогенные пути рецепторов смерти, опосредованные Fas/FasL, а также эндогенные митохондриальные пути и пути эндоплазматического ретикулума. Среди них эндогенный путь апоптоза, опосредованный митохондриями, является основным путем программируемой клеточной смерти в клетках млекопитающих. Bax, представленный про-апоптотическими белками, и Bcl-2, представленный анти-апоптотическими белками, являются основными белками, регулирующими высвобождение митохондриальных факторов апоптоза. Протеаза каспаза является ключевым эффектором апоптоза у млекопитающих, среди которых каспаза-3 - ключевая протеаза семейства каспаз, активирующая различные факторы, стимулирующие апоптоз, и известная как важный исполнитель клеточного апоптоза. BRNP в определенной степени снижает экспрессию каспазы-3 в клетках PC12, поврежденных окислением H2O2. Можно предположить, что BRNP может снижать экспрессию каспазы-3, уменьшать апоптоз клеток и тем самым задерживать старение организма. После воздействия BRNP в клетках PC12 с окислительным повреждением повысился уровень экспрессии Bcl-2, в то время как уровни экспрессии Bax и BRNP снизились в разной степени. Результаты этих исследований могут свидетельствовать о том, что BRNP помогает клеткам противостоять окислительному стрессу, повреждая митохондрии и ДНК, снижает уровень клеточного окислительного повреждения и повышает способность организма регулировать антиоксидантный стресс.