Guanguan Tengzhi G подавляет пролиферацию клеток колоректального рака через сигнальный путь ATM-CH2-p53
Колоректальный рак (КРР), являясь одной из распространенных злокачественных опухолей, по уровню заболеваемости занимает третье место в мире, а по уровню смертности - второе. Несмотря на то, что достижения в области диагностики и лечения позволили продлить жизнь некоторым пациентам, 5-летняя выживаемость по-прежнему составляет всего 64%, что не сильно отличается от показателей 10-летней давности. В настоящее время основным методом лечения колоректального рака является хирургическое вмешательство в сочетании с лучевой и химиотерапией, а его серьезные побочные эффекты значительно снижают качество жизни пациентов. В последние годы соответствующие исследования показали, что натуральные препараты обладают определенными преимуществами в подавлении пролиферации колоректального рака и снижении токсических побочных эффектов радио- и химиотерапии, что делает их важным средством лечения колоректального рака.

Marsdeniatenacissima - (Roxb.) Wight et Arn - лекарственное растение из семейства Asclepiadaceae, произрастающее в основном в таких провинциях, как Юньнань и Гуйчжоу. Исследования показали, что лоза Тунгуань обладает широким спектром фармакологических эффектов, включая противораковое действие, облегчение астмы, регулирование иммунитета, снижение кровяного давления, обезболивание, диурез и облегчение лейкопении у раковых больных, вызванной радиотерапией и химиотерапией. Кроме того, он также используется в клинических условиях для лечения различных опухолей, таких как рак желудка, рак легких, рак печени, лейкемия и т. д., оказывая значительный терапевтический эффект. Исследования показали, что общие сапонины лозы тунгуань оказывают антипролиферативное действие на раковые клетки печени и являются ее основными противораковыми активными ингредиентами. Формула химической структуры тенациссозида G (TG) показана на рисунке 1, и он является одним из компонентов в составе общих сапонинов тенациссозида G. Есть данные исследований, что TG может быть основным активным ингредиентом в лечении немелкоклеточного рака легких в Tongguan Teng, оказывая противораковое действие через многочисленные сигнальные пути, такие как PI3K/Akt. Однако в настоящее время нет сообщений о роли и механизме действия ТГ в борьбе с колоректальным раком. В данном эксперименте в качестве объектов исследования взяты клетки колоректального рака человека RKO и LoVo, изучено влияние ТГ на пролиферативную активность клеток колоректального рака, а также возможный механизм его действия.

Как традиционное китайское лекарство, лоза Тунгуань обладает противораковым действием в клинической практике. По данным соответствующих исследований, противораковое вещество, выделенное из лозы тунгуань, оказывает значительное ингибирующее действие на пролиферацию опухолевых клеток, а его общий экстракт сапонина может вызывать апоптоз клеток и проявлять противораковую активность. Поэтому мы провели исследование фармакологических эффектов и молекулярных механизмов действия основного активного ингредиента - гликозида G лозы тунгуань - на рак толстой кишки. Результаты эксперимента показали, что Tongguan Tengzhi G может значительно подавлять пролиферацию клеток колоректального рака, вызывать повреждение ДНК, активировать ATM-CHK2-p53 путь, вызывать p53 опосредованную остановку клеточного цикла и апоптоз.

Сохранение целостности геномной ДНК имеет решающее значение для роста и пролиферации клеток, однако клетки могут испытывать различные степени повреждения ДНК под воздействием различных физических или химических факторов, как внутренних, так и внешних. Среди них наиболее серьезным типом повреждения ДНК являются разрывы двойных нитей ДНК. Когда ДНК подвергается двухцепочечным разрывам, клеточный механизм ответа на повреждение ДНК фосфорилирует гистоны H2AX, окружающие ДНК, образуя гамма H2AX. Гамма H2AX может скапливаться в месте повреждения в течение нескольких минут, образуя фокусы гамма H2AX, а количество фокусов положительно соответствует уровню двунитевых разрывов ДНК. Поэтому он признан одним из чувствительных молекулярных маркеров двухцепочечных разрывов ДНК. Для выявления внутриклеточных повреждений ДНК после введения ТГ мы впервые использовали метод кометного анализа и обнаружили, что содержание хвостовой ДНК в группе, получавшей препарат, значительно увеличилось, что указывает на индукцию повреждений ДНК в клетках колоректального рака под действием ТГ. Кроме того, результаты иммунофлуоресцентного окрашивания показали, что по сравнению с контрольной группой в группе лечения препаратом значительно увеличилось количество внутриклеточных γ - H2AX положительных очагов и значительно повысился уровень экспрессии γ - H2AX, что еще раз доказывает, что ТГ индуцирует разрывы двойной нити ДНК, вызывая повреждение ДНК.

Ответ на повреждение ДНК - это модификация ДНК, инициируемая организмом для защиты клеток от повреждений при их стимуляции; в основном это активация периодических контрольных точек, репарация повреждений ДНК и апоптоз клеток, индуцированный повреждением ДНК. Пути, используемые для восстановления повреждений ДНК в клетках, сложны и разнообразны. Когда происходит разрыв двойной нити ДНК, рецептор повреждения сразу же распознает повреждение и прибегает к репарации гомологичной рекомбинации и репарации негомологичной концевой рекомбинации. Среди них белок ATM является одним из ключевых звеньев, участвующих в распознавании и репарации повреждений клетки, и он участвует в ответе на повреждение ДНК через два вышеуказанных пути. Когда белок ATM активируется, нижележащая мишень CHK2 подвергается фосфорилированию и активирует p53, вызывая остановку клеточного цикла и индуцируя апоптоз клеток. Среди них остановка прогрессии цикла G1/S в основном вызвана повышением уровня p21, ингибитора циклинзависимой киназы, индуцируемого p53. Результаты проточной цитометрии и вестерн-блота показали, что ТГ может вызывать арест фазы G0/G1, повышая уровень p21 и подавляя экспрессию связанных с циклом белков CDK2, CDK4, CDK6, циклина D1 и циклинаЕ.

Исследования показали, что сигнальный путь ATM-CHK2-p53 играет важную роль в апоптозе клеток, индуцированном повреждением ДНК. Основываясь на эффекте индукции повреждения ДНК, мы провели исследование молекулярного механизма регуляторного влияния ТГ на сигнальный путь ATM-CHK2-p53. Результаты Вестерн-блот эксперимента показали, что через 48 часов после введения ТГ уровень внутриклеточного фосфорилирования ATM и CHK2 значительно увеличился, а экспрессия и уровень фосфорилирования белка р53 также значительно повысились. В то же время мы определили внутриклеточные маркеры апоптоза cleanPARP и cleanCaspase 3 и обнаружили, что уровень их экспрессии значительно повышается при увеличении концентрации препарата, что указывает на то, что ТГ оказывает индуцирующее апоптоз действие на клетки колоректального рака. Можно предположить, что активированный ATM в клетках после обработки ТГ может индуцировать фосфорилирование своего нижележащего белка CHK2 и далее активировать p53, что приводит к опосредованному p53 апоптозу клеток.

Ингибирование клеточного цикла играет важную роль в противодействии пролиферации клеток колоректального рака. Циклины и циклин-зависимые киназы (CDK) регулируют клеточный цикл, образуя комплексы CDK-циклин и фосфорилируя целевые белки в процессе клеточного цикла. Среди них CDK2 CyclinE и CDK4/6-Cyclin D1 играют важную роль в переходе клеток из фазы G1 в фазу S, в то время как p21 оказывает ингибирующее действие на этот процесс трансформации цикла. Благодаря повышению активности р53 под действием ТГ через сигнальный путь ATM-CH2-p53 активированный р53 может инициировать контрольные точки фазы G1/S и вызывать арест клеточного цикла в фазе G0/G1 путем активации р21.

Таким образом, данное исследование показало, что ТГ оказывает ингибирующее пролиферативное действие на клетки колоректального рака, индуцирует остановку фазы G0/G1 и апоптоз. Кроме того, ТГ может вызывать повреждение клеточной ДНК и активировать сигнальный путь ATM-CHK2-p53. Таким образом, это позволяет предположить, что ТГ может вызывать опосредованный р53 арест клеточного цикла и апоптоз, а также подавлять пролиферацию клеток колоректального рака путем регулирования сигнального пути ATM-CH2-p53. Данное исследование дает определенную теоретическую основу для лечения колоректального рака с помощью Guantongteng G, а другие связанные с ним механизмы действия нуждаются в дальнейшем изучении.