Дифференциальный анализ химического состава и верификация клеточного эксперимента рифленых семян и их фальсификатов на основе метаболомики
Гофрированные моллюски - это раковины Arca subcrinata Lischke, Arca granosa Linnaeus или Arca inflata Reeve, которые принадлежат к семейству моллюсков. Они широко используются в традиционной китайской медицине в качестве морских моллюсков и обладают эффектами уменьшения флегмы, устранения застоя крови, смягчения твердости, рассеивания комков, а также облегчения кислоты и боли. Гофрированные камни широко используются в клинической практике для лечения заболеваний желудка, таких как гастроэзофагеальный рефлюкс, острая язва желудка, хронический гастрит и язва желудка; а также для лечения рака щитовидной железы, узлов щитовидной железы, опухолей, язвенного колита, гипертонии и других заболеваний.
Гофрированные моллюски - это целый ряд оригинальных лекарственных трав, а также множество поддельных продуктов, в основном включающих ребристые грубые декорированные моллюски, узловатые моллюски, лодочные моллюски, шаровидные моллюски и волосатые моллюски. Как и другие моллюски традиционной китайской медицины, химический состав семян гофрированных моллюсков состоит из двух основных категорий: неорганических и органических компонентов. Основными неорганическими компонентами являются неорганические соли, состоящие в основном из карбоната кальция, и микроэлементы неорганического происхождения. Согласно Фармакопее Китайской Народной Республики издания 2020 года, содержание карбоната кальция (CaCO3) должно составлять не менее 93,0%. Основными компонентами органических веществ являются белки, аминокислоты, полисахариды и т.д. Органические компоненты обычно составляют от 0,3% до 5,0% от сухого веса скорлупы. Из-за низкого содержания органических компонентов и сложной структуры, а также ограничений в методах и идеях исследования, общая фармакологическая основа моллюсков традиционной китайской медицины является относительно слабой, что приводит к отсутствию специализированных методов идентификации и определения содержания функциональных компонентов в действующих стандартах качества моллюсков традиционной китайской медицины, что затрудняет оценку их внутреннего качества. Систематическая идентификация и анализ его органических компонентов с использованием современных методов исследования является необходимым условием и основой для выяснения его материальной основы и улучшения стандартов качества. В данном исследовании использовалась методика широконаправленной метаболомики TM, которая объединяет преимущества нецелевых (четырехбарная времяпролетная масс-спектрометрия, QTOF) и широконаправленных методов определения метаболитов (количественный мониторинг множественных реакций, MRM). Этот метод сочетает в себе нецелевой (высокое разрешение, широкий охват) и широкоцелевой (высокая чувствительность, точное количественное определение), что делает его пригодным для анализа сложных образцов. Идентификация разновидностей традиционной китайской медицины является ключом к контролю качества традиционной китайской медицины. Технология метаболомики может быть применена для контроля качества традиционной китайской медицины с аналогичной метаболической информацией. В последние годы технология метаболомики широко используется в сравнительных исследованиях качества традиционной китайской медицины. Поэтому в данном исследовании технология широкой мишени была использована для комплексного анализа метаболических компонентов гофрированных моллюсков и их поддельных продуктов, таких как толстый ребристый моллюск, для выявления их дифференциальных метаболитов и поиска потенциальных маркеров качества. Исследования показали, что гофрированные камни оказывают значительное терапевтическое воздействие на рак щитовидной железы. В данном исследовании была выбрана клеточная линия рака щитовидной железы человека TPC-1, что связано с ее традиционной эффективностью, для изучения фармакологических эффектов некоторых дифференциальных метаболитов, что заложило основу для улучшения основы фармакологических веществ и стандартов качества гофрированных семян.

Исследования основ фармакологических веществ и механизма действия семян гофры мало изучены. В данном исследовании впервые была использована технология метаболомики с широким целевым спектром для комплексного анализа метаболических компонентов в семенах гофры и их контрафактной продукции, и в общей сложности было обнаружено 1208 метаболитов из 22 категорий. В основном, включая аминокислоты и их метаболиты, бензол и его производные, гетероциклические соединения, органические кислоты и их производные, альдегиды, кетоны, эфиры, нуклеотиды и их метаболиты и т.д., была предварительно выяснена материальная основа.
На начальном этапе исследовательская группа сравнила традиционные показатели, такие как содержание карбоната кальция, содержание Ca2+ в отваре, содержание водорастворимого экстракта, значение pH водного экстракта и общее содержание аминокислот в семенах гофры и их смешанных продуктах, и результаты не показали существенных различий; для систематического сравнительного анализа были использованы дифференциальный термический анализ, рентгеновская дифракция и рентгеновская флуоресценция, и результаты по-прежнему не показали существенных различий. В данном исследовании был проведен анализ метаболических компонентов подлинных и поддельных продуктов, включающий в общей сложности 1083 метаболических компонента и 167 дифференциальных метаболитов, что свидетельствует о том, что органические компоненты каждого образца были одинаковыми, но также имелись и различия. PCA и кластеризация тепловых карт показали, что три подлинных оригинальных образца могут быть сгруппированы вместе, в то время как поддельные продукты были сгруппированы отдельно, что указывает на то, что метод метаболического анализа с широкой целью имеет хорошее справочное значение для идентификации подлинных и поддельных моллюсков традиционной китайской медицины.
В ходе эксперимента было обнаружено 72 нуклеотида и их метаболиты, в том числе N6-изопентенил-аденозин, аденозин и др. Нуклеозидные вещества играют важную роль в эффективности лекарственных препаратов для животных. Современные исследования показали, что нуклеозидные компоненты обладают такими эффектами, как расслабление гладкой мускулатуры бронхов, антигистаминное, противоастматическое, антибактериальное, противоагрегационное, успокаивающее центральную нервную систему и противосудорожное. Среди них N6-изопентенил аденозин является потенциальным противораковым препаратом. Исследования показали, что после обработки 10 мк моль/л N6 изопентенил аденозина полностью подавляется клоногенная активность в 8 линиях клеток эпителиального рака человека. Аденозин может подавлять пролиферацию клеток рака желудка MGC-803 и способствовать апоптозу, а стресс эндоплазматического ретикулума может быть вовлечен в индуцированный аденозином апоптоз. Эксперименты по проверке клеток показали, что N6-изопентенил аденозин может способствовать апоптозу клеток и ингибировать их пролиферацию, блокируя клеточный цикл в фазах S и G2. При этом уровень изопентенил-аденозина N6 значительно повышается в подлинном продукте, что может служить потенциальным маркером качества для различения подлинных и поддельных гофрированных продуктов. Это указывает на то, что нуклеозидные вещества могут быть важным компонентом фармакологической основы для "разгона мокроты и устранения застоя крови, смягчения твердости и рассеивания узелков" гофрированных семян.
В ходе эксперимента было обнаружено 237 аминокислот и их метаболитов, в том числе 134 малых пептида, включая 12 циклических дипептидов (ЦДП). Современные исследования показали, что ЦДП обладают универсальной биологической активностью и сильным противоопухолевым действием, оказывая ингибирующее влияние на рост различных раковых клеток. Эксперименты по пролиферации клеток показали, что циклический тирозин не оказывает значительного ингибирующего действия на пролиферацию клеток TPC-1, поэтому в будущем необходимо провести дальнейшие исследования.
В подлинных продуктах обнаружено 40 метаболитов, а в поддельных - нет. Среди них бензоат эстрадиола оказывает ингибирующее действие на возникновение рака молочной железы, а механизм его действия связан с регуляцией рецепторов эстрогена ER α и Er β. Токсин HC оказывает значительное антипролиферативное действие на клетки рака молочной железы человека T47D. Фарнезил тиосалициловая кислота - ингибитор RAS и целевого белка рапамицина млекопитающих (mTOR), способный подавлять рост и пролиферацию опухолевых клеток. Ожидается, что эти три вещества будут служить потенциальными маркерами качества гофрированных материалов.
Из-за слабой исследовательской базы традиционной китайской медицины на основе моллюсков и отсутствия справочных материалов и баз данных качественный анализ ее веществ затруднен. В ходе дифференциального анализа метаболитов было обнаружено, что некоторые метаболиты, такие как гинкголид и щавелевая кислота, в основном содержатся в растениях. Для определения их истинных источников необходимы дальнейшие исследования. Впоследствии обнаруженные компоненты должны быть подтверждены эталонными стандартами для повышения точности качественного анализа.