Исследование противоопухолевой активности фенилспиродриановых соединений в грибе Stachybotrys sp. CPCC401591, относящемся к роду плесени виноградного колоса
Гриб Stachybotrys, принадлежащий к семейству Stachybotryaceae, является сапрофитным или слабопаразитирующим видом, широко распространенным в почве, растениях и влажной среде помещений. Вторичные метаболиты, продуцируемые этим родом грибов, имеют богатое разнообразие структурных типов, включая трихотецены, дитерпены, фенилспирадрианы (PSM), поликетоны, антрахиноны, циклические пептиды и алахалазины. Эти соединения обладают значительной биологической активностью в противоопухолевом, антибактериальном, противомалярийном, противовирусном, ингибирующем холестерин-эстеразу и противовоспалительном аспектах. В последние годы из рода Botrytis постоянно выделяют и сообщают о новых активных молекулах соединений. Ли и др. выделили и идентифицировали монотрихотецены из S. chartarum WGC-25C-6, выделенного из губок. Среди них такие соединения, как митоксин A и сатротоксин G, проявляют значительную противоопухолевую активность против HCT-116, HepG2, BGC-823 и других клеточных линий, с IC50<0,01 мк моль/л. Янг и др. выделили шесть дитерпеноидных соединений из гриба J403-SS6, полученного из бумажного винограда морского происхождения. Атранон Q показал значительное ингибирующее действие на патогенные бактерии, включая Candida albicans и Enterococcus faecalis, со значениями МИК 8 и 16 мк г/мл, соответственно.

Семейство соединений PSM очень обширно, и с 1980 года Миядзаки и др. изучали плесень виноградных колосьев S K-76, ингибитор комплемента, был выделен из комплемента, и около 120 молекул соединений класса PSM были идентифицированы и выделены. Ма и др. из S Одиннадцать мономерных соединений класса PSM были выделены из шартарума MXH-X73. Исследования показали, что ботрин D может ингибировать ВИЧ-1 дикого типа и ВИЧ, толерантный к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ) (например, ВИЧ-1 RT-K103N), при этом значения EC50 варьируют от 6,2 до 23,8 мк моль/л. Liu et al. из S Одиннадцать димерных молекул класса PSM (бистахиботирозины L~V) были выделены из Chartarum CGMCC 3.5365. Среди них соединение бистахиботирозин L проявило значительную противоопухолевую активность против клеточных линий HepG2, HCT-116, NCI-H460 и других, причем значения IC50 варьировались от 1,8 до 3,5 мк моль/л.
В данном исследовании для углубленного изучения был выбран эндофитный гриб Stachybotrys sp. CPCC 401591. Объединив технологию OSMAC, анализ молекулярной сети LC-MS/MS и характеристики УФ-поглощения соединений PSM, были изучены фазовое разделение этилацетата и очистка продуктов твердой ферментации риса из штамма CPCC 401591. В то же время, в сочетании с моделями скрининга опухолевых клеток, таких как клеточная линия рака печени человека HepG2, мы стремимся извлечь и изолировать противоопухолевые активные молекулы из этого штамма. Исследование показало, что плесневый гриб CPCC 401591 может производить PSM-соединения и является ресурсной бактерией, заслуживающей дальнейшего изучения.

В данном исследовании с помощью технологии OSMAC и стратегии анализа молекулярных сетей LC-MS/MS в сочетании с различными хроматографическими и современными спектроскопическими методами были выделены 8 PSM-соединений из гриба виноградных колосьев Stachybotrys sp. CPCC 401591. В последние годы в результате поиска и анализа геномных данных нитчатых грибов было установлено, что большинство грибов обычно содержат 40-60 кластеров биосинтетических генов (BGC), связанных с биосинтезом натуральных продуктов. Однако выделенные и идентифицированные в настоящее время метаболиты все еще являются "верхушкой айсберга". Большинство BGC в геноме нитчатых грибов молчат или скрыты, а возможная кодируемая "темная материя" еще не идентифицирована. Технология ОС-МАК нацелена не на активацию конкретных молчащих кластеров генов, а на систематическую модификацию легко управляемых параметров культуры (включая состав среды, значение pH и температуру культуры) для получения структурно новых биологически активных молекул. Это делает технологию OSMAC недорогим, эффективным, универсальным и относительно простым методом исследования для активации микробного вторичного метаболизма. Данное исследование посвящено штамму CPCC 401591 и использует стратегию OSMAC для изучения влияния PDB, BY, F2 и рисовой ферментационной среды на грибные вторичные метаболиты. Исходя из количества и выхода вторичных метаболитов в штамме, рисовая среда была определена как оптимальная среда ферментации, что указывает на то, что технология OSMAC значительно повышает эффективность добычи вторичных метаболитов в этом штамме. В то же время в данном исследовании была применена стратегия анализа молекулярных сетей GNPS для анализа этилацетатной фазы ферментационного экстракта штамма CPCC 401591. Данные вторичной масс-спектрометрии анализируемого вещества сравнивались с данными масс-спектрометрии соединений в базе данных для быстрого определения категорий соединений, содержащихся в анализируемом образце, и дальнейшего содействия эффективному открытию биологически активных молекул.

Соединения PSM в настоящее время выделены только из грибов родов Botrytis и Umeda, что делает их характерными молекулами для этих двух видов грибов. Соединение стакиботрин D проявляет значительную антивирусную активность: значения EC50 варьируют от 6,2 до 23,8 мк М против ВИЧ-1 wt, ВИЧ-1 RT-K103N и других мутантных штаммов. Jia et al. обнаружили, что значения IC50 бистахиботризина K на опухолевых клеточных линиях HCT116 и NCI-H460 варьируют от 1,1 до 4,7 мк М. В данном исследовании изучались вторичные метаболиты в штамме Stachybotrys sp. CPCC 401591. По характерному УФ-поглощению соединений (230, 285, 330 нм) и с использованием различных хроматографических и современных спектроскопических методов были выделены и определены структуры восьми ПСМ-соединений. При последующем анализе GNPS было установлено, что ферментационный экстракт штамма по-прежнему содержит множество мономеров и димерных молекул соединений класса PSM, но мономерные соединения не могут быть получены из-за низкого содержания. Таким образом, больше молекул PSM можно обнаружить путем дальнейшего увеличения выхода ферментации, оптимизации условий ферментации и сочетания технологий ВЭЖХ-УФ-МС. В настоящее время мы завершили секвенирование всего генома штамма Stachybotrys sp. CPCC 401591 и обнаружили два возможных кластера генов биосинтеза psd1 и psd2 PSM-соединений с помощью методов геномного анализа. Оба генных кластера содержат гены, кодирующие поликетидную синтазу и сесквитерпеновую синтазу, в то время как этот генный кластер кодирует большое количество постмодифицирующих ферментов (включая оксидазу P450s, короткоцепочечную дегидрогеназу, ацетилтрансферазу и т.д.). Это закладывает основу для наших будущих исследований по использованию стратегий нокаута генов для выяснения путей биосинтеза соединений PSM и определения функций ключевых биологических ферментов. Таким образом, данное исследование показывает, что гриб Stachybotrys sp. CPCC 401591 может продуцировать PSM-соединения, обогащая структурное разнообразие своих вторичных метаболитов. Это важная ресурсная бактерия, заслуживающая дальнейших исследований.