Дифференциальный анализ вторичных метаболитов между лекарственным и съедобным Polygonatum sibiricum и исследование активных ингредиентов и механизмов действия для улучшения инсулинорезистентности
Под инсулинорезистентностью (ИР) обычно понимают снижение чувствительности клеток-мишеней к количественным концентрациям инсулина при нормальных концентрациях, что приводит к нарушению стимулирования инсулином поглощения и утилизации глюкозы, компенсаторному увеличению секреции инсулина, снижению чувствительности к инсулину и нарушению утилизации глюкозы в таких тканях, как скелетные мышцы, печень и жировая ткань. Среди них ИР является одним из важных звеньев патогенеза сахарного диабета 2 типа, который проходит через весь процесс развития сахарного диабета 2 типа. В настоящее время основными препаратами для лечения ИР являются сенсибилизаторы инсулина, однако они имеют побочные эффекты, такие как переломы, отеки и повреждение печени.

Polygonatum sibiricum Red. - растение, принадлежащее к семейству Liliaceae и роду Polygonatum. Это один из трех видов Polygonatum, включенных в издание Китайской фармакопеи 2020 года. В качестве лекарственного средства используются высушенные клубни, которые являются распространенным лекарственным и съедобным продуктом. Из-за своей узловатой и изогнутой цилиндрической формы, напоминающей куриную голову, он широко известен как куриная голова Polygonatum sibiricum. Он широко распространен в Сычуани, Хунани, Цзянси и других регионах. Он имеет сладкий и мягкий вкус, нетоксичен и обладает свойствами питать ци и инь, укреплять селезенку, увлажнять легкие и благотворно влиять на почки. Он используется для лечения дефицита ци селезенки и желудка, усталости и слабости, внутреннего жара и жажды. В основном содержит полисахариды, сапонины, флавоноиды, алкалоиды, антрахинон и другие компоненты. В клинической практике препарат Хуанцзин широко используется для лечения диабета 2 типа. При диабете 2 типа с дефицитом ци и инь он может облегчить синдромы ТКМ, снизить уровень сахара и липидов в крови, а также улучшить функцию островков поджелудочной железы. Согласно литературным данным, механизм, с помощью которого препарат Huangjing улучшает функцию поджелудочной железы, предполагает, что его активные ингредиенты действуют на такие мишени, как PI3K и STAT3, оказывая дальнейшее влияние на активность серин/треонинов белков, сигнальные пути PI3K-AKT и оказывая свое воздействие; Механизм монотерапии Huangjing в улучшении функции панкреатических островков предполагает, что флавоноиды действуют на постсинаптическую мембрану, изменяя биологические процессы, такие как чувствительность клеток к лекарствам, активность рецепторов нейротрансмиттеров, регулируя сигнальные пути, такие как ионный кальций и гормональная резистентность, для улучшения инсулинорезистентности.

В настоящее время для качественного и количественного исследования химических компонентов Polygonatum sibiricum широко используются ВЭЖХ, ЖХ-МС/МС, UPLC-Q-TOF-MS и другие методы. Сообщалось, что Polygonatum sibiricum содержит флавоноиды, алкалоиды и другие химические компоненты, однако отразить все продукты метаболизма, содержащиеся в Polygonatum sibiricum, в целом сложно из-за небольшого количества обнаруженных компонентов. В последние годы, с развитием технологии метаболомики, для изучения метаболитов традиционной китайской медицины широко используется технология направленной метаболомики на основе UPLC-ESI-MS/MS. По сравнению с традиционными общепринятыми хроматографическими методами, она обладает такими преимуществами, как высокая чувствительность, низкая стоимость и высокая пропускная способность. В связи с отсутствием сообщений о дифференциальном анализе вторичных метаболитов между лекарственным и съедобным Polygonatum sibiricum, данное исследование посвящено лекарственному Polygonatum sibiricum Red и съедобному Polygonatum alternatirrhosum Hand. - Mzt. (широко известные как плоды Polygonatum) в качестве объектов исследования. Впервые для комплексного обнаружения вторичных метаболитов была использована технология UHPLC-ESI-MS/MS, широко направленная на метаболомику, а для сравнительного анализа метаболитов с целью выявления дифференциальных метаболитов - анализ главных компонент (PCA), кластерный анализ HCA и ортогональный частичный дискриминантный анализ по наименьшим квадратам (OPLS-DA); во-вторых, был проведен анализ сетевой фармакологии для десяти лучших соединений с повышенным уровнем относительных изменений в метаболитах между лекарственным и съедобным Polygonatum sibiricum для улучшения резистентности к инсулину. Молекулярный докинг был проведен для активных ингредиентов и ключевых мишеней, а клетки HepG2 были выбраны для проверки клеточного эксперимента. С одной стороны, мы стремимся всесторонне изучить дифференциальные метаболиты между лекарственным и съедобным Polygonatum sibiricum, заложив основу для оценки его качества. С другой стороны, мы планируем провести скрининг потенциальных активных ингредиентов для лечения ИР, обеспечивая основу для выяснения механизма действия Polygonatum sibiricum в лечении ИР.

 

В данной статье анализируются вторичные метаболиты лекарственного и съедобного Polygonatum sibiricum с помощью метаболомики на основе технологии UHPLC-ESI-MS/MS. Было идентифицировано 319 вторичных метаболитов, включая 86 фенольных кислот, 96 флавоноидов, 5 антрахинонов, 25 лигнанов и кумаринов, 3 дубильных вещества, 51 алкалоид, 11 терпенов, 21 стероид и 21 другой метаболит. Вторичные метаболиты Polygonatum sibiricum лекарственного и съедобного происхождения значительно отличаются друг от друга, причем PCA и HCA показали значительные различия. В группе сравнения между лекарственным и съедобным Polygonatum sibiricum было обнаружено 106 дифференциальных метаболитов, в том числе 85 соединений с повышенным уровнем регуляции и 21 соединение с пониженным уровнем регуляции. Лекарственный Polygonatum sibiricum имеет значительные преимущества в количестве и относительном содержании вторичных метаболитов. Для дальнейшего сравнения изменений во вторичных метаболитах между Polygonatum sibiricum лекарственным и съедобным, дифференциальные метаболиты были аннотированы в базе данных KEGG. Результаты классификации и обогащения KEGG показали, что Polygonatum sibiricum лекарственный был значительно обогащен в метаболических путях флавоноидов, флавонолов, изофлавонов и алкалоидов, что может быть связано с формированием качества Polygonatum sibiricum лекарственного. Согласно литературным данным, в процессе роста под воздействием стресса или неблагоприятных факторов окружающей среды растения вырабатывают широкий спектр вторичных метаболитов. Эти метаболиты часто имеют специфические биологические функции, такие как засухоустойчивость, устойчивость к болезням и борьба с вредителями. В то же время, накопление этих вторичных метаболитов также полезно для улучшения лекарственных качеств частей растений. Например, накопление флавоноидов способствует улучшению антиоксидантного, противовоспалительного и противоопухолевого действия; накопление алкалоидов проявляет высокий противораковый эффект и ингибирует активность альфа-глюкозидазы; стероидные сапонины обладают различными биоактивными компонентами, такими как противовоспалительное и противоопухолевое действие. Поэтому углубленный анализ этих дифференцированно накапливающихся флавоноидов, алкалоидов и стероидных соединений полезен для скрининга маркеров качества, связанных с качеством лекарственного Polygonatum sibiricum.

В настоящее время в разделе "Хуанцзин" издания 2020 года Китайской фармакопеи нет ограничений по содержанию вторичных метаболитов, таких как флавоноиды и алкалоиды. В данном исследовании мы сравнили десять лучших соединений по относительным изменениям содержания метаболитов между лекарственным и съедобным Polygonatum sibiricum и обнаружили, что 50% метаболитов относятся к флавоноидам, что согласуется с классификацией KEGG и результатами обогащения дифференциальных метаболитов. Среди них метаболиты с высокой фармакологической активностью, такие как изорамнетин, обладают хорошими противоопухолевыми, противогипоксическими, противоишемическими, облегчающими стенокардию, противоаритмическими, лечащими ишемическую болезнь сердца и гипертонию, очищающими свободные радикалы кислорода, снижающими уровень холестерина в сыворотке крови, защищающими сердечно-сосудистую систему, способствующими кровообращению и другими биологическими эффектами, и широко используются в клинической практике; Сапонины тонкого ямса также обладают определенной физиологической активностью в противоопухолевом, антибактериальном, паразитоубийственном, гемолизирующем, липидопонижающем, противоостеопорозном, противомутационном и других аспектах. Дифференцированное повышение уровня ресвератрола и диосцина наблюдалось только у Polygonatum sibiricum Red, вида, происходящего от Polygonatum sibiricum. Исходя из этого, следующим шагом будет использование Polygonatum sibiricum (плодов Polygonatum sibiricum) в качестве контроля для изучения Polygonatum sibiricum из фармакопеи et Hemsl.Polygonatum cyrtonema Hua и местные лекарственные сорта Polygonatum sibiricum (такие как широко распространенный Polygonatum sibiricum в Наньчуне, Сычуани, Сюйшане, Чунцине, Синьхуа, Хунане и т.д.) были использованы в качестве экспериментальных групп для анализа изменений вторичных метаболитов в каждой сравнительной группе на основе обширной целевой метаболомики. В сочетании с биологической активностью конкретных категорий метаболитов были отобраны метаболиты, связанные с качеством традиционной китайской медицины Polygonatum sibiricum, что создало основу для оценки качества и контроля качества подлинного Polygonatum sibiricum.

Для того чтобы подтвердить активность дифференциально повышенных соединений, выявленных с помощью метаболомики, в данном исследовании объединили традиционную эффективность Хуанцзина в укреплении селезенки и лечении синдрома внутреннего жара и жажды. Используя ИР в качестве модели заболевания, был проведен анализ сетевой фармакологии. Результаты анализа путей KEGG показали, что три дифференциально повышенных соединения, а именно изорамнетин, нарингин и изонарингин, были вовлечены в сигнальный путь PI3K Akt, сигнальный путь mTOR, сигнальный путь VEGF и сигнальный путь эстрогена. Обогащение AMPK и других сигнальных путей является очень значительным. Изучив и проанализировав предыдущую литературу, можно сделать вывод, что сигнальный путь PI3K/AKT участвует в клеточном цикле, апоптозе, пролиферации и метаболизме глюкозы, а инсулин в основном действует на мышцы, печень и жировую ткань. Он активирует сигнальный путь PI3K/AKT, связываясь с рецепторами инсулина, тем самым регулируя процессы метаболизма глюкозы и жиров; сигнальный путь mTOR участвует в регуляции потребления глюкозы скелетными мышцами и инсулинорезистентности. Активация этого пути может повысить чувствительность к инсулину, но чрезмерная активация может подавить чувствительность к инсулину; VEGFA, как важный целевой белок сигнального пути VEGF, улучшает резистентность к инсулину, повышая чувствительность к инсулину в жировой и мышечной ткани, тем самым контролируя уровень глюкозы в крови; Аденозин активированная протеинкиназа (AMPK) является важным веществом, которое регулирует энергетический обмен в организме. Исследования показали, что различные природные соединения могут активировать AMPK, повышать чувствительность к инсулину и являются потенциальными мишенями для улучшения инсулинорезистентности. Кроме того, мишень Хуанцзин в улучшении ИР может также действовать на смежные пути, такие как сигнальный путь эстрогена, регулировать гипофизарно-надпочечниковую ось и другие ткани и органы, а также прямо или косвенно улучшать ИР. Приведенные выше результаты исследований согласуются с результатами применения мономера изорамнетина в лечении диабета. Кроме того, для дальнейшего раскрытия механизма действия Polygonatum sibiricum в улучшении ИР была использована технология молекулярного докинга. Результаты показали, что ключевые мишени сигнального пути PI3KAkt, сигнального пути mTOR, сигнального пути VEGF, сигнального пути эстрогена, сигнального пути AMPK и т.д. хорошо стыкуются с изорамнетином, гликозидом каэмпферола и гликозидом изокаэмпферола, с энергиями связывания ≤ -20,9 кДж/моль. Таким образом, можно предположить, что связывание активных ингредиентов Polygonatum sibiricum с ключевыми мишенями может быть ключом к терапевтическому эффекту Polygonatum sibiricum при ИР. Дальнейшие эксперименты на клетках подтвердили, что изорамнетин, дифференцированный метаболит, может эффективно улучшать состояние ИК клеток HepG2, в основном за счет влияния на экспрессию белков, связанных с сигнальными путями PI3K, AKT1, VEGF и mTOR. Результаты показали, что изорамнетин может повышать уровень экспрессии белков PI3K и AKT1 и снижать уровень экспрессии белков VEGF и mTOR в ИК-клетках HepG2.

Таким образом, в данной статье с помощью технологии направленной метаболомики точно и всесторонне определены вторичные метаболиты в лекарственном и съедобном Polygonatum sibiricum. По сравнению со съедобным Polygonatum sibiricum, повышенное содержание таких соединений, как изорамнетин, в лекарственном Polygonatum sibiricum действует на сигнальные пути PI3K, AKT1, VEGFA и mTOR через основные мишени, такие как PI3K, AKT1, VEGF и mTOR, улучшая ИК, что полностью отражает фармакологические характеристики традиционной китайской медицины с множеством компонентов, целей и путей. Результаты исследования закладывают основу для скрининга и оценки качества активных ингредиентов Polygonatum sibiricum, а также создают основу для выяснения механизма действия Polygonatum sibiricum в лечении ИР.