Исследование антиколоректального действия байкалина на клетки HCT116 на основе сигнального пути Hippo
Колоректальный рак (КРР) - распространенная злокачественная опухоль пищеварительного тракта. Последние данные онкологической статистики показывают, что распространенность и смертность от КРР в мире стремительно растут из-за старения населения, изменения привычек питания, ожирения, курения и других факторов, занимая третье и второе места соответственно. Уровень заболеваемости CRC в развитых странах примерно в четыре раза выше, чем в развивающихся. Несмотря на то, что в последние годы CRC совершил значительный прорыв в диагностике и методах лечения, пятилетняя выживаемость при нем по-прежнему ниже 10%. Химиотерапия является краеугольным камнем противоопухолевого лечения. 5-фторурацил, оксалиплатин, иринотекан и другие широко используемые препараты для лечения КРР часто ограничены в клиническом применении из-за токсических побочных эффектов, таких как мукозит, подавление костного мозга и обезвоживание. Поэтому изучение патогенеза CRC и поиск терапевтических препаратов с низкой токсичностью и сильным таргетным действием остаются в центре внимания современных исследований CRC.
Практика доказала, что традиционная китайская медицина обладает множеством преимуществ в противоопухолевом лечении. Она может не только повысить эффективность химиотерапевтических препаратов, уменьшить побочные реакции, обратить вспять лекарственную устойчивость, но и улучшить прогноз и повысить качество жизни пациентов. Кроме того, традиционная китайская медицина содержит различные активные ингредиенты, и исследования показали, что многие активные ингредиенты могут оказывать противоопухолевое действие, влияя на миграцию, инвазию и апоптоз клеток. Поэтому традиционная китайская медицина и ее активные ингредиенты имеют хорошие перспективы развития для лечения опухолей. Скутелларин (SCU), флавоноидное соединение, получаемое в основном из традиционной китайской медицины Scutellaria baicalensis, Scutellaria baicalensis и Scutellaria baicalensis, обладает различными фармакологическими эффектами, такими как противовоспалительный, антиоксидантный, антифибротический, нейропротекторный, защита сердечно-сосудистой и цереброваскулярной систем. Недавние исследования показали, что SCU также обладает обширной противоопухолевой активностью, которая может подавлять возникновение и развитие различных злокачественных опухолей, таких как колоректальный рак, рак печени, рак легких, плоскоклеточная карцинома пищевода и т.д. Это потенциальный противоопухолевый препарат.
В последнее десятилетие сигнальный путь Hippo широко изучается в области исследования рака. Исследования подтвердили, что аномальная блокада сигнального пути Hippo тесно связана с выживанием, пролиферацией, инвазией и развитием лекарственной устойчивости в опухолевых клетках. При ингибировании сигнального пути Hippo основные эффекторные факторы этого пути, Yes associated protein (YAP)/Transcription co activator with PDZ binding motif (TAZ) 3, подвергаются ядерной транслокации и агрегируются в ядре, связываясь с факторами транскрипции TEA 1-4 и способствуя транскрипции нижележащих целевых генов, таких как регулятор клеточного цикла циклин E1 и онкоген c-Myc. Сигнальный путь Hippo играет важную роль в поддержании нормального гомеостаза кишечника, а также в восстановлении и регенерации поврежденных тканей. Высокая активность YAP/TAZ часто является независимым предиктором плохого прогноза в CRC и положительно коррелирует со стадией опухоли, состоянием лимфатических узлов и метастазированием. Кроме того, аномальная активация YAP/TAZ связана с отсутствием вышележащих регуляторных факторов в сигнальном пути Hippo. Отсутствие стерол-20-подобной киназы 1/2 (MST1/2) или большого опухолевого супрессора 1/2 (LATS1/2) может приводить к различной степени активации YAP/TAZ.
К настоящему времени эффект SCU против CRC был подтвержден во многих аспектах. Исследования показали, что SCU может оказывать свое действие через различные сигнальные пути, включая Hedgehog, Wnt/β - катенин и другие. Однако в настоящее время нет исследований, посвященных противораковому эффекту SCU через регулирование сигнального пути Hippo. Поэтому в данном исследовании в качестве модели in vitro используются клетки колоректального рака HCT116 для изучения влияния SCU на пролиферацию, миграцию и апоптоз колоректальных опухолевых клеток, а также изучения механизма его действия, обеспечивающего справочную и экспериментальную базу для разработки терапевтических препаратов для лечения CRC.

 

Все больше данных свидетельствуют о том, что SCU может подавлять возникновение и развитие опухолей через различные пути и имеет потенциал для разработки противоопухолевых препаратов. Сунь и др. обнаружили, что SCU может значительно подавлять пролиферацию клеток немелкоклеточного рака легких PC-9 и H1975. Результаты исследования Han et al. также показывают, что SCU может значительно подавлять пролиферацию клеток остеосаркомы человека 143B и U2OS в зависимости от концентрации. В данном исследовании SCU значительно снижал активность клеток колоректальной опухоли HCT116, ингибировал клонирование клеток и препятствовал их пролиферации, что согласуется с вышеизложенным выводом.
При раке раковые клетки часто приобретают способность к пролиферации и инвазии в результате эпителиально-мезенхимального перехода. При гепатоцеллюлярной карциноме Лю и др. обнаружили, что SCU может ингибировать эпителиально-мезенхимальный переход раковых клеток печени и снижать их способность к инвазии и метастазированию путем снижения активности сигнального пути Янус-киназа 2 (JAK2)/сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции 3 (STAT3). Li et al. обнаружили, что при раке желудка SCU может регулировать активность сигнального пути PTEN/PI3K, снижать уровень экспрессии E-кадхерина в клетках рака желудка MGC-803 и AGS, повышать уровень экспрессии виментина и N-кадхерина, а также ингибировать эпителиально-мезенхимальный переход клеток рака желудка. В данном исследовании результаты анализа клеточного скретча показали, что по сравнению с группой холостого контроля скорость миграции клеток HCT116 в группе, обработанной SCU, значительно снижалась в зависимости от концентрации, что указывает на ингибирующий эффект SCU на миграционную способность колоректальных опухолевых клеток, что согласуется с результатами предыдущих исследований.
В настоящее время широко распространено мнение, что недостаточный апоптоз клеток является важной причиной возникновения и развития опухолей. Поэтому индуцирование апоптоза опухолевых клеток считается эффективным средством лечения опухолей. Исследование Cao et al. подтвердило, что SCU может блокировать цисплатиноустойчивые клетки аденокарциномы легких A549 в фазе G0/G1 и индуцировать апоптоз путем ингибирования путей AKT/mTOR/4EBP1 и STAT3. При раке печени Сюй и др. обнаружили, что SCU может снижать активность сигнального пути STAT3 путем ингибирования выработки реактивных видов кислорода (ROS) в клетках рака печени HepG2, тем самым снижая уровень экспрессии нижележащих целевых белков BCL-XL и MCL-1 и индуцируя апоптоз клеток. Аналогичным образом, в данном исследовании с помощью двойного окрашивания Hoechst 33342/PI и проточной цитометрии мы обнаружили, что SCU может индуцировать клеточный апоптоз и значительно увеличивать скорость апоптоза клеток HCT116. Однако конкретный регуляторный механизм SCU все еще неясен, поэтому в последующих исследованиях будут проведены дальнейшие изыскания.
Исследования показали, что сигнальный путь Hippo может участвовать в регуляции клеточной пролиферации, а чрезмерная активация или экспрессия YAP может привести к чрезмерной клеточной пролиферации в различных тканях, таких как печень, желудочно-кишечный тракт, кожа и сердце. Кроме того, YAP и TAZ являются активными индукторами эпителиально-мезенхимального перехода в клетках. Высокая активность YAP и TAZ может индуцировать экспрессию ключевого транскрипционного регулятора ZEB1/2 в эпителиальном мезенхимальном переходе, тем самым способствуя эпителиальному мезенхимальному переходу. Сигнальный путь Hippo также играет важную регуляторную роль в клеточном апоптозе. YAP может способствовать клеточному апоптозу, регулируя транскрипцию антиапоптотических генов, таких как COX-2, Survivor и Glut1; кроме того, сверхэкспрессированный YAP может блокировать апоптоз, вызванный фактором некроза опухоли, FAS и химиотерапией; исследование He et al. также подтвердило, что YAP может управлять AKT-зависимым фосфорилированием NR4A1 через Ser351, изолируя его в ядре и ослабляя его роль в продвижении клеточного апоптоза.
Результаты этого исследования показывают, что SCU может повышать уровень экспрессии мРНК и белка MST1 и LATS1 в клетках HCT116, снижать уровень экспрессии мРНК и белка YAP1 и TAZ, способствовать фосфорилированию YAP и повышать уровень экспрессии белка p-YAP (Ser127). Таким образом, предполагается, что роль SCU может быть связана с активацией сигнального пути Hippo. Результаты qRT ПЦР показали, что обработка SCU в течение 24 часов эффективно увеличивала уровни экспрессии мРНК Bax, каспазы-3 и каспазы-9 в клетках HCT116, одновременно снижая уровень экспрессии мРНК Bcl-2; Вестерн-блот анализ также показал, что SCU значительно увеличивала уровень экспрессии про-апоптотического белка Bax и снижала уровень экспрессии анти-апоптотического белка Bcl-2 в клетках HCT116. Кроме того, уровни экспрессии мРНК и белка c-Myc значительно снижались через 24 часа после обработки SCU. Полученные результаты свидетельствуют о том, что SCU может активировать каскад Hippo YAP/TAZ, способствовать фосфорилированию YAP/TAZ, ингибировать его транскрипционную активность, подавлять экспрессию нижележащего целевого гена c-Myc, снижать уровень экспрессии члена семейства белков апоптоза Bcl-2, повышать уровень экспрессии Bax, и мигрируют в митохондрии, способствуя высвобождению цитохрома С и образованию апоптозного комплекса, тем самым активируя фактор инициации апоптоза каспазу-9 из семейства каспаз и фактор исполнения апоптоза каспазу-3, вызывая апоптоз клеток по митохондриальному пути, препятствуя росту клеток колоректального рака и оказывая антиколоректальное противораковое действие.
Таким образом, данное исследование показало, что SCU может значительно подавлять пролиферацию и миграцию клеток колоректального рака HCT116, а также индуцировать апоптоз клеток. Механизм его действия может быть связан с активацией сигнального пути Hippo. Однако, учитывая сложные причины возникновения колоректального рака и различия между линиями опухолевых клеток из разных источников, противораковый эффект SCU еще предстоит подтвердить на множестве других клеточных линий колоректального рака и всесторонне изучить в экспериментах на животных in vivo. Кроме того, сообщалось, что сигнальные пути Wnt, Notch, Hedgehog и BMP могут участвовать в регуляции гомеостаза и регенерации кишечника, а исследования показали, что сигнальный путь Hippo может взаимодействовать с этими путями, что приводит к перекрестному взаимодействию. Поэтому необходимо дополнительно изучить, оказывает ли SCU противораковое действие на колоректальный рак путем комплексной регуляции активности сигнального пути Hippo и его перекрестного взаимодействия.