Диабетическая нефропатия (ДН) является наиболее распространенным микрососудистым осложнением сахарного диабета и наиболее частой причиной развития болезни почек в конечной стадии (БПН). Современный патогенез диабетической нефропатии сложен и включает изменения почечной гемодинамики, ишемию, окислительный стресс, воспалительную активацию и активацию ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), что приводит к почечному фиброзу и в конечном счете влияет на функцию почек. Своевременное блокирование почечного фиброза может эффективно предотвратить прогрессирование ДН до ESRD.

Активация сигнального пути RhoA/ROCK опосредует процессы фиброза при различных заболеваниях, включая диабетическую нефропатию, а ингибиторы ROCK, представленные фасудилом, показали хороший эффект против фиброза почек при ДН. Нарингенин (NRG) - это вид флавоноидного соединения, очищенного из цитрусовых растений, которое обладает разнообразными эффектами, такими как антиаритмический, антиатеросклерозный, противовоспалительный, антифиброзный, антивирусный, противоопухолевый и так далее. Он широко используется в исследованиях in vivo и in vitro. Однако исследования роли нарингина при диабетической нефропатии (ДН) в настоящее время ограничены. Поэтому в данном исследовании была воспроизведена модель мышиной ДН, которую лечили нарингином, чтобы наблюдать за прогрессированием фиброза почек при ДН. В то же время мы использовали фасудил в качестве положительной контрольной группы для дальнейшего изучения влияния нарингина на сигнальный путь RhoA/ROCK.

32 мыши линии C57BL/6 были случайным образом разделены на нормальную группу, модельную группу, группу нарингина и группу фасудила. После успешного воспроизведения модели ДН мышей лечили нарингином и фасудилом, а нормальную группу и модельную группу - физиологическим солевым раствором. Мышей подвергали эвтаназии в течение 12 недель подряд для наблюдения за изменениями креатинина сыворотки (Scr), 24-часового количественного определения белка в моче (24-часовое Upro), глюкозы в крови и массы тела; для наблюдения за морфологическими изменениями в почках использовали окрашивание HE и Masson; Иммуногистохимия использовалась для наблюдения за уровнями RhoA, ROCK1, ROCK2, коллагена типа I (Col1) и коллагена типа III (Col3) в почках; Вестерн-блот анализ почечного RhoA ROCK1、ROCK2、p-MYPT1、 Уровни ламинина (LN) и фибронектина (FN)

Ранние патологические изменения при нефропатии ДН представлены в основном гломерулосклерозом, повреждением почечных артериол и тубулярной дегенерацией, постепенно приводящей к почечному фиброзу. На поздней стадии наблюдается обильная протеинурия и почечная недостаточность. Нарингин - один из представителей флавоноидов. Вэньли и др. обнаружили, что нарингин может облегчить почечный фиброз и защитить функцию почек у крыс с ДН путем снижения регуляции сигнального пути TGF - β 1/smad. Дальнейшие исследования Ning et al. показали, что нарингин повышает экспрессию let-7a, который негативно регулирует рецептор 1 трансформирующего фактора роста - β 1 (TGFBR1), тем самым подавляя сигнальный путь TGF - β 1/smad и леча диабетическую нефропатию. Кроме того, нарингин может замедлять прогрессирование диабетической нефропатии и защищать функцию почек, снижая уровень окислительного стресса, подавляя экспрессию воспалительных факторов и способствуя апоптозу клеток. В данном исследовании модель мышей с диабетом 1 типа была создана путем внутрибрюшинной инъекции STZ, после чего их продолжали кормить в течение 4 недель, а 24 ч Upro был в два раза больше, чем до моделирования, что рассматривалось как успешное воспроизведение модели DN. После моделирования экспрессия ФН нарингенина 50 мг/(кг - д) уменьшилась, фиброз почек уменьшился, протеинурия и функция почек улучшились, а сахар крови и масса тела не имели значительных изменений по сравнению с модельной группой, что указывает на то, что нарингенин и фасудил могут улучшить фиброз почек при ДН, не влияя на массу тела и сахар крови.

RhoA - член суперсемейства Ras среди малых молекулярных гуанозинтрифосфат (GTP) связывающих белков. Тирозинкиназы и рецепторы, связанные с белками G, могут рекрутировать и активировать факторы обмена гуанин-нуклеотидов (GEF) RhoA, тем самым переводя RhoA из неактивного состояния связывания ВВП в активное состояние связывания ГТФ. RhoA играет роль молекулярного переключателя для достижения перехода между двумя состояниями, воздействуя на нижележащие сигнальные молекулы для получения биологических эффектов. Rho-ассоциированная протеинкиназа (ROCK) - первая обнаруженная молекула эффектора RhoA, которая в настоящее время наиболее изучена с функциональной точки зрения. Относительная молекулярная масса ROCK составляет около 160 кДа, она относится к семейству серин/треониновых протеинкиназ. Существует два подтипа ROCK: ROCK1 и ROCK2, оба из которых имеют три основных структурных домена: каталитический киназный домен на N-конце, домен в виде спирали, содержащий домен связывания Rho (RBD) в середине, и домен pH, богатый цистеином (CRD) на С-конце. Аминокислотные последовательности ROCK1 и ROCK2 идентичны на 65%, а гомология киназных доменов достигает 92%. ROCK экспрессируется в большинстве тканей, но в разных тканях наблюдается гетерогенность. ROCK1 в основном экспрессируется в печени, яичках, селезенке, почках, легких и т.д., а ROCK2 - в мозге, скелетных мышцах, сердце и т.д. Сигнальный путь, состоящий из RhoA/ROCK, участвует в регуляции физиологической активности, такой как клеточная пролиферация, адгезия, миграция и апоптоз, через взаимодействие с нижележащими субстратами, такими как легкая цепь миозина (MLC), MYPT-1, CPI-17, ERM и др. В патологических условиях сигнальный путь RhoA/ROCK повышает секрецию различных профибротических факторов, таких как фактор роста тромбоцитов (PDGF), ангиотензин II (AngII), эндотелин-1 (ET-1), хемоаттрактантный фактор моноцитов (MCP-1), интерлейкин-6 (IL-6), трансформирующий фактор роста - β 1 (TGF - β 1), фактор роста соединительной ткани (CTGF) и др. ROCK также может вызывать активацию ядерного фактора каппа B (NF - κ B), который, в свою очередь, повышает секрецию профибротических факторов, таких как фактор некроза опухоли (TNF - α) и IL-1 β. Фасудил в настоящее время является первым и единственным одобренным ингибитором ROCK для клинического применения. Благодаря мощному сосудорасширяющему эффекту, он широко используется при заболеваниях, связанных со спазмом сосудов, таких как субарахноидальное кровоизлияние и ишемическая болезнь сердца. Он может эффективно связываться с АТФ-зависимыми киназными доменами, блокируя ROCK и ингибируя передачу сигнала по сигнальному пути RhoA/ROCK. В области диабетической нефропатии фасудил также широко изучался и улучшает ДН за счет воздействия на множество путей, включая: (1) ингибирование активации NF - κ B, FN и TGF - β, снижение воспалительной реакции и облегчение гломерулосклероза; (2) содействие формированию клеток подоцитов, восстановление аномального сократительного движения, снижение проницаемости гломерулярной фильтрационной мембраны и образования протеинурии; (3) Ингибировать процесс эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) эпителиальных клеток почечных канальцев и ослабить интерстициальный фиброз почек; (4) Расширить сосудистую сеть почек, улучшить почечную гемодинамику и уменьшить повреждение почек. В этом исследовании, по сравнению с нормальной группой, экспрессия RhoA, ROCK1 и ROCK2 в тканях почек мышей модельной группы значительно увеличилась, уровень фосфорилирования MYPT1 Thr853 увеличился, а активность ROCK возросла; В группе фасудила по сравнению с модельной группой экспрессия RhoA, ROCK1 и ROCK2 в почечной ткани значительно снижалась, уровень фосфорилирования MYPT1 Thr853 снижался, активность ROCK ослабевала, наблюдалось снижение белка в моче и улучшение функции почек; В группе нарингина, как и в группе фасудила, наблюдалось значительное снижение экспрессии RhoA, ROCK1 и ROCK2 в почечной ткани по сравнению с модельной группой. Уровень фосфорилирования MYPT1 Thr853 был снижен, а активность ROCK ослаблена, что сопровождалось уменьшением количества белка в моче и улучшением функции почек. Однако статистически значимой разницы в различных показателях между группой фасудила и группой нарингина не было. Этот экспериментальный результат позволяет предположить, что сигнальный путь RhoA/ROCK1 участвует в формировании почечного фиброза у мышей DN, а улучшение состояния почечного фиброза у мышей DN, вызванное нарингином, может быть связано с подавлением сигнального пути RhoA/ROCK1.

Таким образом, экспериментальные исследования на животных показывают, что нарингин может значительно уменьшить степень фиброза почек у мышей с ДН, а механизм его действия может быть связан с понижением регуляции сигнального пути RhoA/ROCK. Однако его конкретный механизм и место действия требуют дальнейшего углубленного изучения на клеточном и молекулярном уровнях.