Предварительное исследование защитного эффекта икариина, активирующего сигнальный путь Nrf2, против D-галактоза-индуцированного повреждения клеток Сертоли 15P-1 яичек мыши
В связи с непрерывным развитием экономики и общества и усилением давления на выживание людей бесплодие стало глобальной проблемой. Исследования показали, что около 15% пар в мире страдают от бесплодия, причем на мужские факторы приходится около 50%, а механизм до конца не изучен. Клетки Сертоли яичек, как единственные соматические клетки, связанные со сперматогенными клетками, структурно окружают сперматогониальные стволовые клетки, сперматогонии и различные уровни сперматогенных клеток, образуя кровеносный барьер яичка через различные белки плотного соединения, такие как Occludin и Claudin-1. Исследования показали, что клетки, поддерживающие яички, выделяют различные факторы роста, такие как нейротрофический фактор линии глиальных клеток (GDNF), костный морфогенетический протеин-4 (BMP4) и фактор стволовых клеток (SCF), которые регулируют пролиферацию и дифференцировку сперматогониальных стволовых клеток и способствуют образованию сперматозоидов. В другом исследовании было обнаружено, что у крыс-самцов, подвергавшихся воздействию шестивалентного хрома во время беременности, после взросления наблюдается снижение экспрессии белков плотного соединения Occludin и Claudin-1 в опорных клетках, что приводит к повышенному апоптозу сперматогенных клеток и нарушению выработки сперматозоидов. При стимуляции тепловым стрессом клетки Сертоли яичек крупного рогатого скота повреждаются, а уровни мРНК GDNF и SCF снижаются, что приводит к дисфункции сперматозоидов. Таким образом, улучшение структуры и функции поддерживающих клеток может стать новым направлением в лечении мужского бесплодия.

Эпимедиум - традиционное китайское лекарственное растение с питательными свойствами, впервые записанное в "Шэньнун бэнькао цзин". Она обладает свойствами тонизировать почечный ян, укреплять мышцы и кости, а также рассеивать ветер и сырость. Современные фармакологические исследования показали, что Epimedium оказывает значительное влияние на замедление старения и усиление мужской репродуктивной функции. Его основным действующим веществом является икариин (ICA). Исследования показали, что ICA может способствовать пролиферации первичных клеток Сертоли у крыс и усиливать функцию мужских клеток Сертоли. Исследования показали, что ICA может улучшать репродуктивную функцию крыс, повышая уровень экспрессии мРНК рецепторов фолликулостимулирующего гормона и белка плотного соединения Claudin-11 в поддерживающих клетках, тем самым улучшая антиоксидантную устойчивость тканей яичек к стрессу. Ядерный фактор эритроидного типа 2 (Nrf2), являясь основным регулятором системы клеточной защиты организма, регулирует экспрессию ряда генов, кодирующих антиоксидантные белки и белки ответа на окислительный стресс, связываясь с энхансерными последовательностями в промоторной регуляторной области элементов антиоксидантного ответа (ARE), координируя тонкую настройку реакции на различные стрессовые условия и вредные воздействия и достигая гомеостаза клеточного микроокружения. Исследования показали, что Epimedium может облегчить вызванное окислительным стрессом повреждение печени путем активации Nrf2. Наше предыдущее исследование показало, что ICA может облегчить повреждение ДНК в зародышевых клетках яичек стареющих крыс за счет регуляции Nrf2. ICA может регулировать экспрессию белков Occludin и Claudin-1, связанных с герметичными соединениями, в линии клеток поддержки яичек мыши TM4, индуцированной D-Gal. Однако в настоящее время нет данных о том, может ли ICA улучшить D-Gal-индуцированное повреждение клеток 15P-1 через сигнальный путь Nrf2. Предыдущие исследования показали, что D-Gal может вызывать повреждение плотного соединения в клетках линии поддерживающих клеток яичка мыши TM4. Поэтому в данном эксперименте использовали D-галактозу (D-Gal) - индуцированные клетки 15P-1 в качестве модели повреждения, чтобы изучить защитный эффект и механизм ICA на повреждение клеток Сертоли через сигнальный путь Nrf2.

В последние годы ВОЗ признала бесплодие проблемой общественного здравоохранения. Уровень заболеваемости бесплодием в общей популяции растет из года в год, затрагивая около 15% пар детородного возраста в мире. Исследования показывают, что в США и других западных странах количество сперматозоидов ежегодно уменьшается на 1,5%, и, по оценкам, около 70 миллионов пар во всем мире стали жертвами бесплодия или стерильности. Крупномасштабное эпидемиологическое исследование, проведенное ВОЗ, показало, что примерно в половине случаев бесплодие пар вызвано мужскими факторами, и механизм его возникновения до конца не изучен.

Исследования показали, что D-Gal может уменьшить количество и функции поддерживающих клеток мышиной линии клеток TM4. Поэтому мы выбрали модель D-Gal для оценки того, может ли ICA облегчить повреждение клеток 15P-1. В литературе имеются сообщения о том, что после обработки эндотелиальных клеток ECV-304 35, 70 и 140 мк М ICA уровень ингибирования клеток составил 1,2% и не было отмечено значительной цитотоксичности. Результаты МТТ показали, что по сравнению с контрольной группой, когда ICA использовался один для лечения клеток 15P-1, IC50 был более 50% при концентрации 40 мк М, что указывает на отсутствие значительной цитотоксичности ICA. Наши предварительные исследования показали, что ICA оказывает защитное действие на повреждение клеток TM4, обработанных D-Gal, и обладает значительным пролиферативным эффектом в концентрациях 0,5 и 1 мк М. Результаты МТТ в этом эксперименте также показали, что по сравнению с группой обработки D-Gal, ICA увеличивал выживаемость клеток в зависимости от концентрации в 0,125-1 мк М и оказывал значительный стимулирующий эффект на пролиферацию клеток в концентрациях 0.Эффект ICA ослабевал при концентрации более 1 мк М, что может быть связано с более длительным временем стимуляции D-Gal клеток 15P-1 в этом эксперименте, более серьезным повреждением клеток и значительным повышением чувствительности поврежденных клеток к стимуляции препаратом, что проявляется в феномене стимулирования низкой концентрацией и ингибирования высокой концентрацией. Клетки Сертоли яичек - это соматические клетки, расположенные в семявыносящих канальцах яичек и непосредственно связанные со сперматогенными клетками. Они регулируют пролиферацию и дифференцировку сперматогониальных стволовых клеток и способствуют образованию сперматозоидов, секретируя различные цитокины, такие как GDNF, BMP4 и SCF. GDNF - член суперсемейства трансформирующего фактора роста бета и важный фактор регуляции пролиферации сперматогониальных стволовых клеток. Он играет важнейшую роль в развитии мужских репродуктивных клеток и раннем развитии яичек. BMP4 и SCF являются важными факторами, способствующими дифференцировке сперматогониальных стволовых клеток. Предыдущие исследования нашей научной группы показали, что общие флавоноиды Epimedium могут повышать уровень мРНК и белка GDNF, BMP4 и SCF, секретируемых клетками Сертоли в естественно стареющих яичках крыс, улучшая секреторную функцию клеток Сертоли. Результаты показали, что по сравнению с контрольной группой уровни экспрессии мРНК и белка факторов, секретируемых клетками Сертоли, значительно снизились после обработки D-Gal, в то время как уровни экспрессии мРНК и белка факторов, секретируемых клетками Сертоли, значительно повысились в 15P-1 после обработки ICA. ICA может улучшить секреторную функцию клеток Сертоли яичек 15P-1.

Важнейшим компонентом барьера кровяного яичка являются плотные соединения между опорными клетками, включающие в себя три семейства трансмембранных белков - Occludin, Claudin и белки адгезии, а также семейство цитоплазматических белков блокирующего соединения. Плотные соединения между клетками не только защищают репродуктивные клетки от вторжения иммунной системы и обеспечивают хорошую физиологическую среду для сперматогенеза, но и позволяют пре- и постфинишным сперматоцитам регулярно проходить через кровеносный барьер семенника для дальнейшего развития. Исследования показали, что Occludin и Claudin являются самыми ранними белками мембраны плотного соединения, а способность плотного соединения и функция эпителиального барьера в основном опосредованы Claudin. Другое исследование показало, что введение синтетического пептида Occludin в семенники крыс может обратимо уничтожить большинство сперматогоний через 27 дней, а нокаут Occludin in vitro также может привести к снижению функции плотного соединения опорных клеток. Результаты этого эксперимента показали, что по сравнению с контрольной группой экспрессия белка плотного соединения в клетках 15P-1 снизилась после обработки D-Gal, в то время как экспрессия белка плотного соединения в опорных клетках 15P-1 значительно повысилась после обработки ICA. ICA оказывает защитное действие на повреждение белка плотного соединения в опорных клетках 15P-1.

Когда организм находится в нормальном состоянии, Kelch like ECH associated protein-1 (Keap1) рекрутирует Nrf2 и образует комплекс в цитоплазме, который разрушается под действием убиквитиновых протеаз; когда происходит окислительный стресс, Nrf2 диссоциирует от Keap1, и Nrf2 переносится из цитоплазмы в ядро для связывания с ARE, активируя транскрипцию защитных генов, таких как HO-1 и NQO1, тем самым противостоя окислительному стрессу, вызванному различными раздражителями в организме. Наши предыдущие исследования показали, что ICA может уменьшить повреждение ДНК яичек у естественно стареющих крыс и улучшить снижение репродуктивной функции, вызванное старением, за счет активации сигнального пути Nrf2/HO-1. Это позволяет предположить, что улучшение сперматогенной дисфункции под действием ICA может быть связано с сигнальным путем Nrf2. Предыдущие исследования показали, что ICA может улучшить D-Gal-индуцированное повреждение клеток опорной линии яичек TM4. Поэтому в данном исследовании использовали Вестерн-блот для выявления белков пути Nrf2. Результаты показали, что по сравнению с контрольной группой уровни экспрессии важных белков Nrf2-пути Nrf2, HO-1 и NQO-1 в клетках 15P-1 были значительно снижены после стимуляции D-Gal, в то время как после введения ICA они были значительно повышены. Затем мы определили экспрессию и локализацию Nrf2 с помощью технологии иммунофлюоресценции. По сравнению с группой нормального контроля, флуоресцентная экспрессия Nrf2 в ядре клеток 15P-1 в группе лечения D-Gal была ослаблена, но улучшилась после лечения ICA. Полученные результаты позволяют предположить, что функциональные и структурные повреждения клеток 15P-1 связаны с подавлением сигнального пути Nrf2, что приводит к снижению антиоксидантной способности клеток. ICA может улучшить повреждение клеток 15P-1 за счет повышения их антиоксидантной способности.

Таким образом, ICA может повышать уровень экспрессии секретируемых белков GDNF, BMP4, SCF, а также белков плотного соединения Occludin и Claudin-1 в клетках 15P-1 путем активации сигнального пути Nrf2, тем самым улучшая D-Gal-индуцированное повреждение в клетках 15P-1. Этот эксперимент заложил теоретическую основу для наших последующих исследований защитного эффекта и механизма воздействия ICA на половые клетки, чтобы лучше изучить прикладное значение китайской травяной медицины Epimedium в репродуктивной системе и обеспечить новые направления для клинического лечения мужского бесплодия.