Влияние сульфорафана на Nrf2-опосредованную антиоксидантную способность в скелетных мышцах мышей, подвергшихся острой гипотермии
Скелетные мышцы - важный орган, обеспечивающий теплопродукцию в организме в условиях низкой температуры. Скелетные мышцы поддерживают температурный гомеостаз организма посредством как дрожательной, так и недрожательной теплопродукции в условиях низкой температуры. Этот процесс требует гидролиза большого количества АТФ для преобразования ее химической энергии в необходимую организму тепловую энергию. Скелетные мышцы в основном удовлетворяют потребности в теплопродукции за счет увеличения скорости окисления и распада жирных кислот в условиях низкой температуры, при этом увеличение скорости окисления жирных кислот в митохондриях сопровождается ускоренным образованием реактивных видов кислорода (ROS). Предыдущие исследования показали, что острое или длительное воздействие низких температур увеличивает скорость метаболизма в состоянии покоя и уровень ROS в скелетных мышцах мышей. Повышение уровня ROS может привести к окислительному повреждению белков, нуклеиновых кислот и липидов скелетных мышц, тем самым влияя на двигательную активность и восстановление скелетных мышц. Поэтому своевременное удаление большого количества ROS, образующихся в скелетных мышцах в условиях низкой температуры, и повышение их антиоксидантной способности имеют решающее значение для поддержания их нормальных физиологических функций.
Система антиоксидантной защиты, опосредованная связанным с ядерным фактором E2 фактором 2 (Nrf2), играет важнейшую роль в поддержании клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза. Когда клетки подвергаются окислительному стрессу, Nrf2 в цитоплазме не убиквитинируется и не деградирует под действием своего негативного регуляторного белка Kelch like cyclooxygenase related protein-1 (Keap1). Он проникает в ядро и связывается с элементами антиоксидантного ответа (ARE) на многочисленных промоторах генов, повышая экспрессию большинства антиоксидантных ферментов и ферментов фазы II детоксикации, оказывая защитное действие против окислительного стресса в организме. Однако исследования показали, что острое или длительное воздействие низких температур значительно снижает экспрессию мРНК и белка Nrf2 в тканях и органах сердца, печени и легких мышей, что указывает на то, что низкая температура окружающей среды может ингибировать экспрессию Nrf2 в тканях и органах. Однако ни в нашей стране, ни за рубежом нет данных о том, подавляет ли острая гипотермия экспрессию Nrf2 и антиоксидантную способность скелетных мышц.

Сульфорафан (SFN) в изобилии содержится в крестоцветных растениях и признан специфическим активатором Nrf2. Поэтому в данном исследовании предпринята попытка сначала изучить влияние острой гипотермии различной продолжительности (1 час и 3 часа) на экспрессию Nrf2 и антиоксидантных ферментов, а также антиоксидантную способность в скелетных мышцах мышей; кроме того, на основании этого было изучено влияние введения SFN перед низкотемпературным воздействием на систему антиоксидантных ферментов, опосредованных Nrf2, и редокс-гомеостаз глутатиона в скелетных мышцах. Данное исследование позволит получить предварительные экспериментальные данные для изучения возможности использования SFN в качестве добавки к спортивному питанию при низкотемпературных воздействиях.

Nrf2 - основной регуляторный фактор, поддерживающий окислительно-восстановительный гомеостаз скелетных мышц. В предыдущих исследованиях сообщалось, что воздействие низкой температуры подавляет экспрессию Nrf2 в таких тканях и органах, как сердце, печень и легкие, что приводит к образованию большого количества РОС в этих органах, которые не могут быть очищены. Однако не было сообщений о влиянии острой гипотермии на экспрессию Nrf2 и антиоксидантную способность скелетных мышц. Поэтому в данном исследовании сначала изучалось влияние 1 и 3 часов воздействия низкой температуры на Nrf2-опосредованную антиоксидантную систему в скелетных мышцах. Результаты показали, что уровень транскрипции мРНК Nrf2 в скелетных мышцах мышей, подвергшихся трехчасовому воздействию низкой температуры, был значительно снижен, в то время как уровень ROS был значительно повышен. Последующие экспериментальные результаты также показали, что по сравнению с группой PBS+Con экспрессия белка Nrf2 в скелетных мышцах мышей в группе PBS+Cold имела тенденцию к снижению, а уровень T-AOC был значительно снижен, в то время как уровень ROS имел тенденцию к увеличению. Предполагается, что 3-часовое воздействие низкой температуры может подавлять экспрессию Nrf2 в скелетных мышцах мышей и снижать их антиоксидантную способность.

Воздействие низкой температуры в течение 3 часов снижает антиоксидантную способность скелетных мышц, что может быть связано с ингибированием экспрессии антиоксидантных ферментов, опосредованной Nrf2, и окислительно-восстановительного гомеостаза глутатиона. В предыдущих исследованиях сообщалось, что 3-часовое воздействие острой гипотермии может значительно снизить экспрессию SOD1 в почках, легких и бурой жировой ткани мышей. Прерывистое воздействие низкой температуры (8 часов в день в течение 3 дней) значительно снижало активность GPX1 и экспрессию белка HMOX1 в легочной ткани крыс. Длительное воздействие низкой температуры (4 часа в день, 6 дней в неделю, в общей сложности 2 недели) значительно снижало активность SOD1 и экспрессию белка CAT в тканях мозга мышей. Исследование показало, что по сравнению с группами 0 и 1 ч уровень транскрипции мРНК генов антиоксидантных ферментов (Gpx1, Hmox1, Cat, Sod1, Nqo1) в скелетных мышцах мышей в группе 3 ч был значительно снижен. Последующие результаты эксперимента также показали, что по сравнению с группой PBS+Con уровни транскрипции мРНК генов антиоксидантных ферментов (Gpx1, Hmox1, Cat, Sod1, Nqo1) в скелетных мышцах мышей в группе PBS+Cold имели тенденцию к снижению, а экспрессия белков HMOX1 и CAT была значительно снижена. Можно предположить, что 3-часовое воздействие низкой температуры может подавлять транскрипцию и трансляцию антиоксидантных ферментов, опосредованных Nrf2, и тем самым влиять на антиоксидантную способность скелетных мышц. Кроме того, исследования показали, что острая низкотемпературная экспозиция может снижать содержание GSSG и соотношение GSH/GSSG в эритроцитах человека, а также уменьшать содержание GSH в тканях печени и желудка крыс. Результаты данного исследования показали, что по сравнению с группой PBS+Con содержание GSSG в скелетных мышцах и соотношение GSH/GSSG у мышей в группе PBS+Cold значительно увеличилось и уменьшилось, соответственно, в то время как содержание GSH существенно не изменилось. Это указывает на то, что накопление GSSG может быть основной причиной снижения соотношения GSH/GSSG.

Специфический активирующий эффект SFN на Nrf2 был широко подтвержден. В одном из исследований было обнаружено, что 12-недельное диетическое воздействие SFN активировало регулируемую Nrf2 антиоксидантную ферментную систему в мышцах разгибателей пальцев пожилых мышей, улучшая мышечную силу и выносливость к физическим нагрузкам. Кроме того, крысам внутрибрюшинно вводили SFN за три дня до изнурительной тренировки, что приводило к снижению активности лактатдегидрогеназы и креатинфосфокиназы в плазме крови, а также к повышению экспрессии и активности белков Nrf2 и антиоксидантных ферментов (NQO1, GST, GSR) в латеральной мышце бедра. Также увеличилось время и расстояние от тренировки до истощения. Результаты исследования свидетельствуют о том, что активация Nrf2 с помощью SFN играет важную роль в повышении антиоксидантной способности и выносливости к физическим нагрузкам. Поэтому, чтобы улучшить снижение антиоксидантной способности скелетных мышц в течение 3 часов низкотемпературного воздействия, мы добавляли мышам SFN перед 3 часами низкотемпературного воздействия. Результаты эксперимента показали, что по сравнению с группой PBS+холод, у мышей группы SFN+холод наблюдалось значительное увеличение экспрессии мРНК и белка Nrf2 в скелетных мышцах, а также T-AOC, и значительное снижение уровня ROS. Напомним: Активация Nrf2 с помощью SFN может увеличить T-AOC скелетной мышцы, подвергнутой воздействию низкой температуры в течение 3 часов, устранить избыток ROS и оказать положительное влияние на поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза скелетной мышцы.

Добавка SFN повышает антиоксидантную способность скелетных мышц мышей, подвергшихся воздействию низких температур, что тесно связано с активацией Nrf2-опосредованной антиоксидантной ферментной системы под действием SFN. Эндогенные антиоксидантные ферменты, регулируемые Nrf2, являются основными исполнителями клиренса ROS. Например, SOD1 катализирует расщепление супероксидных анион-радикалов с образованием кислорода и перекиси водорода; CAT может расщеплять перекись водорода на воду и кислород; GPX1 катализирует образование воды и соответствующих спиртов из перекиси водорода или органических перекисей, используя GSH в качестве субстрата; NQO1 катализирует реакцию двухэлектронного восстановления хинона с образованием гидрохинона, способствует выведению хинона и предотвращает образование ROS из хинона посредством реакции одноэлектронного восстановления; HMOX1 катализирует распад токсичного свободного гемоглобина с образованием биливердина, CO и ионов железа с функцией антиоксидантного повреждения. Результаты исследования показали, что введение SFN перед 3-часовым воздействием низкой температуры значительно повышало уровень транскрипции мРНК генов антиоксидантных ферментов скелетных мышц (Gpx1, Hmox1, Cat, Sod1, Nqo1) и экспрессию белков HMOX1 и SOD1 у мышей группы SFN+холод по сравнению с группой PBS+холод. Полученные результаты свидетельствуют о том, что SFN активирует Nrf2 и усиливает транскрипцию и трансляцию генов этих антиоксидантных ферментов.

Кроме того, добавка SFN повышает антиоксидантную способность скелетных мышц у мышей, подвергшихся воздействию низких температур. Помимо увеличения экспрессии антиоксидантных ферментов, это также тесно связано с активацией SFN Nrf2-опосредованной окислительно-восстановительной системы глутатиона. Глутатион представляет собой трипептид, состоящий из глутаминовой кислоты, цистеина и глицина, и является важным олигопептидом с малой молекулярной активностью в системе антиоксидантной защиты организмов. Глутатион в основном существует в клетках в форме GSH. Активная тиоловая группа цистеина в его молекуле может отдавать электроны ROS, после чего GSH превращается в стабильный димер GSSG, не позволяя ROS постоянно захватывать электроны, тем самым защищая белки, липиды и нуклеиновые кислоты от окислительного повреждения и поддерживая окислительно-восстановительный гомеостаз клеток. Образование GSH в организме происходит в основном по двум путям: синтез и восстановление. Во-первых, глутаминовая кислота и цистеин катализируются GCLC и GCLM с образованием глутамилцистеина, затем глутамилцистеин и глицин катализируются GSS с образованием GSH; во-вторых, GSSG может быть восстановлен до GSH под действием NADPH и GSR. Таким образом, Gclc, Gclm, Gss и Gsr являются ключевыми ферментными генами, которые регулируют выработку GSH и являются целевыми генами Nrf2. Мы обнаружили, что после введения SFN уровень транскрипции мРНК генов глутатионсинтазы Gclm, Gss и Gsr в скелетных мышцах мышей группы SFN+холод значительно повысился по сравнению с группой PBS+холод, а содержание GSH и GSSG значительно снизилось. Предполагается, что это может быть следствием острого низкотемпературного стресса, а добавка SFN может усилить синтез de novo и пути восстановления GSH. Однако GSH играет важную роль в устранении большого количества ROS, образующегося в результате острого низкотемпературного воздействия, что в конечном итоге приводит к значительному расходу GSH. По ключевому показателю оценки окислительно-восстановительного баланса организма, соотношению GSH/GSSG, видно, что соотношение GSH/GSSG в группе SFN+холод значительно повышено.

В целом, данное исследование показывает, что 3-часовое воздействие острой гипотермии подавляет Nrf2-опосредованную антиоксидантную активность. Перед воздействием низкой температуры введение сульфорафана активировало антиоксидантные ферменты, опосредованные Nrf2, и антиоксидантные системы глутатиона, повышая антиоксидантную способность скелетных мышц.