Распространение эндофитных бактерий и предварительный скрининг штаммов, продуцирующих стероидные сапонины, в Сянмайдоне на разных стадиях роста
Сянмайдун, также известный как хубейский майдун Liriope spicata var. prolifera Y.T. Ma, является одним из исходных растений шанмайдуна в Фармакопее Китайской Народной Республики (издание 2010 года). Стероидные сапонины являются его основным действующим веществом, а основной скелет сапогенина относится к производным спиростана (состоит из 27 атомов углерода). В соответствии с конфигурацией C25 в структуре спиростана и циклическим состоянием кольца F, он может быть разделен на следующие четыре основных типа: спиростанол (C25 - конфигурация S), изостеростанол (C25 - конфигурация R), фуростанол (кольцо F - производное с открытой цепью), модифицированные спиростаноловые спирты (кольцо F - пятичленное тетрагидрофурановое кольцо). Из Ophiopogon japonicus было выделено 14 типов стероидных сапонинов, основными гликозидами которых являются диосгенин и рускогенин, оба из которых являются C25 (S) изомерами. Среди них относительно высоко содержание сапонинов C (Ls-S3) в Ophiopogon japonicus. Стероидные сапонины обладают разнообразной фармакологической активностью, и, за исключением некоторых, которые могут быть химически синтезированы, их в основном получают непосредственно из традиционных китайских лекарственных материалов путем химической экстракции. Стероидные сапонины Сянмайдуна не являются исключением. Однако из-за таких проблем, как длительный производственный цикл, постоянные препятствия для выращивания в полевых условиях, низкое содержание сапонинов, высокая стоимость экстракции и значительное загрязнение окружающей среды, устойчивое производство и поставки стероидных сапонинов сянганмайдуна ограничены. Поэтому необходимо искать новые способы получения сапонинов в больших количествах.

Ранее были проведены исследования, в которых сообщалось о выделении эндофитных бактерий, способных производить стероидные сапонины, из зданий Дяньчжун и Хуачжун. Вдохновившись этим, наша исследовательская группа попыталась выделить и обнаружить штаммы эндофитных бактерий, которые метаболизируют и производят стероидные сапонины из Сянмайдуна. Используя методы чистой культуры и технологию 16SrDNA-PCRDGGE, мы проанализировали и определили распределение эндофитных бактерий в образцах (клубнях или корнях) сянганмайдуна во время его первоначального появления, быстрого роста и зрелого периода сбора урожая. В то же время методы цветной реакции, ТЛК и ВЭЖХ использовались для предварительной оценки способности полученных чистых культивируемых штаммов к производству сапонинов, чтобы получить целевые штаммы и обеспечить теоретическую поддержку "фабричного, масштабного и быстрого" производства стероидных сапонинов.

Используя традиционные методы культивирования чистых микроорганизмов, в данном исследовании было выделено 15 родов и 22 вида эндофитных бактерий из корнеклубней и волокнистых корней сянганмайдуна на разных стадиях роста. Среди них было 4 вида Bacillus и 4 вида Staphylococcus, 2 вида Pseudomonas, а остальные 12 родов, включая Salmonella, Enterobacter, Pseudoxanthomonas, Morganella, Agrobacterium, Microbacterium, Porphyromobacter, Acinetobacter, Lysinibacter и Sphingosine. В родах Sphingomonas, Sphingomonas и Curtobacterium есть только один вид бактерий.

В результате идентификации 16SrDNA PCR DGGE было установлено, что структура эндофитного бактериального сообщества Xiangmaidong была практически одинаковой в период первоначального появления, быстрого роста и зрелого сбора клубней, с небольшими различиями в группах штаммов. Путем выравнивания последовательностей из выделенных последовательностей были идентифицированы 15 родов и 21 вид бактерий, включая 3 вида Bacillus и 3 вида Staphylococcus, 2 вида Serratia и 2 вида Pseudomonas, а остальные 11 родов, включая Pseudomonas, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Porphyromobacter, Curtobacterium, Enterobacter, Methylobacterium, азотфиксирующие. Есть только по одному штамму Azotobacter, Microbacterium и Pseudoclavibacter. По сравнению с 22 штаммами чистых эндофитных бактерий, упомянутых выше, с помощью ДГГЭ было выявлено 7 новых родов: Serratia, Pectobacterium, Bordetella, Stenotrophomonas, Methylobacterium, Azotobacter и Pseudomonas.

В данном исследовании оценивалась способность к производству сапонинов чистых культивируемых эндофитных штаммов и предварительно были выделены три штамма бактерий: Pseudoxanthomonas mexicana, Staphylococcus caprae и Microbacterium testaceum, обладающие значительными характеристиками по производству стероидных сапонинов. Согласно результатам ВЭЖХ, все эти три эндофитные бактерии показали характерные пики в моменты времени 15,98, 57,64 и 75,19 минут, что указывает на то, что по крайней мере три сапонина в их продуктах ферментации могут иметь одинаковую структуру, что требует дальнейшей экспериментальной проверки. В настоящее время существует две основные стратегии обнаружения стероидных сапонинов: прямая и косвенная - с помощью качественного и количественного анализа расщепленных сапонинов. Ученые использовали метод ВЭЖХ для определения содержания диосцина в Dioscorea nipponica, маранте, сизале и бутонах лилии. Из-за отсутствия стандартных и выделенных чистых образцов стероидных сапонинов сянганмайдуна в данном эксперименте, приготовленные стероидные сапонины корня сянганмайдуна (смесь) были временно использованы в качестве положительного контроля. Сравнивая, появлялись ли характерные пики в одной и той же временной точке при одинаковых условиях обнаружения, можно предварительно определить особенности производства гликозидов эндофитными бактериями. В будущем наша лаборатория продолжит отделение и очистку экстракта сапонинов продукта ферментации, а также будет использовать масс-спектрометрию, ядерный магнитный резонанс и другие методы для более точного определения характеристик.

На основе DGGE-анализа высоковариабельной области 16SrDNA V6 ～ V8 и в сочетании с результатами скрининга чистых культивируемых эндофитных бактерий, способных продуцировать стероидные сапонины, в этом эксперименте был обнаружен феномен: в период быстрого роста и зрелого сбора корневых клубней сянганмайдуна из корневых клубней можно обнаружить мексиканскую псевдожелтую псевдомонаду P. Присутствие mexicana не было обнаружено на начальной стадии корневых клубней. Было подтверждено, что биомасса и содержание стероидных сапонинов в корневых клубнях сянганского майдуна постепенно увеличиваются с начальной стадии и достигают своего пика на стадиях быстрого роста и зрелости урожая. Означает ли это явление, что Pseudomonas aeruginosa в Мексике играет положительно коррелирующую роль в накоплении стероидных сапонинов в клубнях Ophiopogon japonicus? Это также требует дальнейшей экспериментальной проверки.