Сравнительное исследование спектров характеристик ВЭЖХ и содержания мультииндексных компонентов в различных спецификациях лекарственного сырья Цинпи
Впервые о Цинпи было написано в книге "Жемчужный сак". Ли Шичжэнь сказал: "Кожура Цинчжу была бесполезна в древние времена, но только при династии Сун медики начали ее использовать". Только при династии Сун незрелые и зрелые апельсиновые корки сравнили и обнаружили, что они обладают несколько разными лечебными свойствами, отсюда и различие между корками Цинцзю и Хуанцзю. Цинпи - это высушенная или недозрелая кожура плодов Citrus reticulata Blanco и его культурных сортов семейства Рутовые (Rutaceae). В медицине используются две различные спецификации Цинпи: сбор молодых плодов, которые падают с земли в мае-июне, сушка их на солнце и широко известны как "Geqingpi"; сбор незрелых плодов с июля по август, продольное разрезание их на четыре лепестка от кожицы до основания, удаление всех лепестков и сушка на солнце, широко известная как "Четырехцветковая зеленая кожица". Зеленая кожа имеет теплый характер, горький и резкий вкус. Возвращается к меридианам печени, желчного пузыря и желудка. Оказывает успокаивающее действие на печень и расщепляет ци, уменьшая скопления и устраняя застойные явления. Применяется при болях в груди и ребрах, грыже, нагрубании молочных желез, скоплении пищи и застое ци, а также при растяжении и болях в животе. Основными компонентами цинпи являются летучие масла, флавоноиды, аминокислоты и др. Современные фармакологические исследования показали, что Цинпи оказывает регулирующее действие на желудочно-кишечный тракт, способствует оттоку желчи, оказывает антиаритмическое действие, отхаркивающее действие и лечит мастит. Две разновидности зеленой кожи имеют несколько разные функциональные показания. Один тип зеленой кожи в основном направлен на устранение застоя ци, а другой - на регулирование печени и ци.
Кроме того, эти два продукта имеют небольшие различия в своем составе. В издании Китайской фармакопеи 2020 года содержатся различные положения о характеристиках и идентификации различных спецификаций зеленой кожуры, а в пунктах определения содержания установлены предельные требования только для гесперидина. Результаты исследований Ли и др. показали, что содержание гесперидина и синоменина в Geqingpi было выше, чем в Sihuaqingpi, а содержание N-метил-амина и летучего масла - ниже. Тенденция высокого и низкого содержания четырех компонентов в двух образцах из разных регионов была в основном одинаковой. Чжао и др. использовали ГХ-МС для анализа летучих масел Eucommia ulmoides и Eucommia ulmoides и обнаружили, что девять соединений, включая гераниол, неролидол и α-изотерпинен, являются уникальными для Eucommia ulmoides. Содержание основных компонентов, лимонена и линалоола, было более чем в два раза выше, чем в Eucommia ulmoides, в то время как содержание других компонентов сильно варьировалось. Йи и др. также указали на наличие определенных различий в составе Geqingpi и Sihuaqingpi, используя газовую и жидкостную хроматографию для изучения их компонентов. Все вышеперечисленные исследования указывают на то, что между Geqingpi и Sihuaqingpi существуют различия в химическом составе.
В данном исследовании с помощью ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) были получены спектры характеристик Цинпи и Сихуа Цинпи в сочетании с хемометрическими методами для сравнения различий между двумя спецификациями Цинпи и сравнения содержания пяти эффективных ингредиентов в двух спецификациях лекарственных материалов Цинпи, что послужило основой для улучшения стандартов количества Цинпи в двух спецификациях.

 

Приготовление тестового раствора. В данном исследовании использовали однофакторный анализ для оценки влияния экстракционных растворителей (метанол, 70% метанол, 50% метанол, этанол, 70% этанол, 50% этанол), методов экстракции (ультразвуковая экстракция, нагревание под рефлюксом) и времени экстракции (15, 30, 45 минут) на характеристические спектры и определение содержания каждого компонента, с хроматографическим пиком "общая площадь пика/размер образца" и содержанием синоменина, гесперидина, нарингина и гесперидина в качестве оценочных показателей. Результаты показали, что наилучший эффект дает нагревание под рефлюксом с метанолом 70% в течение 30 минут.
Составление и анализ карт признаков. Результаты исследования карт признаков показали, что в картах признаков UPLC Geqingpi и Sihuaqingpi было 7 общих пиков. Пять характерных компонентов Geqingpi и Sihuaqingpi были идентифицированы с помощью эталонных стандартов, а именно: синоменин, нарингин, гесперидин, нарингин и гесперидин. Мы исследовали различные водные фазы (0,1% фосфорной кислоты и 0,1% муравьиной кислоты), два различных типа хроматографических колонок Waters ACQUITY HSS T3 (100 мм × 2,1 мм, 1,8 мкм), YMC Triart C18 (100 мм × 2,1 мм, 1.9 мкм), и сравнили влияние различных длин волн обнаружения (275 нм и 284 нм), температуры колонки (38, 40, 42 ℃) и скорости потока (0,28, 0,30, 0,32 мл/мин) на хроматографические пики характерных спектров Qingpi. Результаты показали, что при использовании хроматографической колонки Waters ACQUITY HSS T3 (100 мм × 2,1 мм, 1,8 мкм) с 0,1% муравьиной кислоты в качестве водной фазы, в условиях хроматографии с длиной волны обнаружения 275 нм, температурой колонки 40 ℃, и скоростью потока 0,30 мл/мин, были получены хроматографические пики. Степень разделения хорошая, базовая линия стабильная, количество хроматографических пиков высокое, а сигнал соответственно высокий.
Разница в химическом составе между Geqingpi и Sihuaqingpi. Характерные спектры UPLC различных спецификаций лекарственного сырья Цинпи, полученные в этом исследовании, выявили 7 общих пиков в Geqingpi и Sihuaqingpi, из которых 5 характерных пиков были идентифицированы. Пик 1 был определен как синоменин; пик 3 - гликозид кожуры помело Yunxiang; пик 4 - гесперидин; пик 6 - экстракт Chenpi; пик 7 - экстракт кожуры апельсина. В этом исследовании HCA, PCA и OPLS-DA были использованы для классификации различных спецификаций лекарственного сырья из зеленой кожуры на две категории; дальнейший анализ показывает, что химические компоненты, представленные пиками 1, 4 и 2, являются дифференциальными компонентами между этими двумя спецификациями лекарственных трав Qingpi. Таким образом, эти три компонента могут быть использованы в качестве точек входа для дальнейшего анализа, чтобы отличить эти две спецификации лекарственных трав Цинпи.
Флавоноиды являются основными активными ингредиентами цинпи. Результаты определения содержания пяти известных флавоноидов в Geqingpi и Sihuaqingpi показали, что содержание синоменина и гесперидина в Geqingpi выше, чем в Sihuaqingpi, в то время как содержание нарингина и гесперидина в Geqingpi было ниже, чем в Sihuaqingpi. В целом, содержание нарингина в двух спецификациях Qingpi Yunxiangyupi было относительно одинаковым. Анализ независимого выборочного t-теста показал, что различия в содержании синоменина, гесперидина и нарингина были статистически значимыми. Этот результат согласуется с результатами исследований Ли и др. Помимо флавоноидов, изученных в данном эксперименте, летучее масло также является одним из эффективных компонентов лекарственных трав Цинпи. Исследование Чжао летучих масел Geqingpi и Sihuaqingpi показало, что девять соединений, включая гераниол, неролидол и α-изотерпинен, являются уникальными для Geqingpi. Основные компоненты, лимонен и линалоол, более чем в два раза превышают содержание в сихуацинпи. При клиническом применении функциональные показания "Зеленой кожи четырех цветов" более мягкие, чем у "Кожи Гецина", что может быть связано с меньшим содержанием активных ингредиентов, таких как гесперидин и синоменин, а также летучего масла в "Зеленой коже четырех цветов" по сравнению с "Кожей Гецина". Согласно соответствующей литературе, Geqingpi - это молодые плоды, собранные в мае-июне, а Four flowered green skin собирают с незрелых плодов в июле-августе, и разница между ними заключается во времени сбора и стадии зрелости. Из приведенных выше результатов видно, что различные стадии роста и развития могут влиять на накопление активных ингредиентов в Qingpi. Однако в период репродукции и развития активные ингредиенты в цинпи не просто увеличиваются или уменьшаются, а, скорее, несколько увеличиваются и несколько уменьшаются: Экстракт ченпи и гесперидин демонстрируют тенденцию к увеличению; симулин, гесперидин и нарингин - к уменьшению. Приводят ли различия в этих показателях прямо или косвенно к разной эффективности различных спецификаций Цинпи, требует дальнейших фармакологических экспериментов для доказательства. Основываясь на различиях в содержании пяти активных ингредиентов в двух разных спецификациях Цинпи, а также на разном акценте двух эффектов, мы можем лучше реализовать дифференциацию синдромов и лечение синдромов традиционной китайской медицины и повысить эффективность лечения, если рецепт будет отдельно маркирован для использования в клинических условиях. Между тем, если в действующих фармакопейных стандартах будут установлены отдельные стандарты качества для Geqingpi и Sihuaqingpi, это будет способствовать контролю качества лекарственного сырья Qingpi.