Исследование иммуномодулирующего действия сапонинов из Panax ginseng и Panax ginseng на клетки RAW 264.7 in vitro
Макрофаги, участвующие в неспецифическом иммунитете организма, являются первой линией защиты от патогенов. Активированные макрофаги могут выделять различные факторы воспаления и цитокины (такие как NO и TNF - α) для участия в иммунном ответе организма и регулирования иммунного ответа. Исследования показали, что сапонины в традиционной китайской медицине могут активировать макрофаги, усиливать фагоцитарную способность клеток, способствовать секреции соответствующих активных молекул и регулировать экспрессию соответствующих белков. Сапонины корней Radix Pseudostellaria fibroblast roots (RPFRS) - один из биоактивных компонентов, выделенных из корней женьшеня Pseudostellaria heterophylla, которые обладают эффектами повышения иммунитета, антиокисления и так далее. В настоящее время основной корень женьшеня используется в качестве лекарства, а корневой шелк выбрасывается, что приводит к большим потерям. Исследования показали, что среднее содержание общих сапонинов в корневом шелке женьшеня Panax в 1,14 раза больше, чем в корневом клубне. Предварительные исследования исследовательской группы показали, что экстракт женьшеня Panax и Panax ginseng, состоящий в основном из сапонинов, оказывает иммунопротекторное действие на иммуносупрессированных мышей и может повысить их иммунную функцию. В настоящее время имеется мало сообщений об иммунных эффектах только RPFRS, а мононуклеарные макрофаги мыши (клетки RAW 264.7) часто используются в качестве модели для исследований иммунной активности in vitro. Поэтому в данном эксперименте были выбраны клетки RAW 264.7 и изучены иммуномодулирующие эффекты и возможные механизмы действия RPFRS in vitro путем определения иммунологических показателей, таких как пролиферация клеток, фагоцитарная активность, соответствующие цитокины и экспрессия мРНК. Цель исследования - обогатить иммунологическое содержание RPFRS и обеспечить теоретическую основу для разработки и использования женьшеня Panax.

 

Влияние РПФРС на пролиферацию клеток RAW 264.7. Сапонины обладают определенными гемолитическими и токсическими свойствами и имеют более низкие токсические дозы по сравнению с другими растительными экстрактами, поэтому при их использовании следует обращать внимание на дозировку. Чтобы определить, оказывает ли RPFRS токсическое действие на клетки RAW 264.7, и подобрать оптимальную концентрацию RPFRS для экспериментов, был использован метод МТТ для определения влияния различных концентраций RPFRS на пролиферацию клеток RAW 264.7. Результаты этого эксперимента показали, что RPFRS может значительно способствовать пролиферации клеток RAW 264.7 в диапазоне концентраций 12,5-800 мк г/мл (P<0,01), а в диапазоне концентраций 12,5-100 мк г/мл наблюдалась зависимость "доза-ответ". Поэтому для последующих экспериментов были выбраны концентрации 12,5-200 мк г/мл.

Влияние РПФРС на фагоцитарную активность клеток RAW 264.7. Фагоцитоз - одна из основных функций макрофагов. В неспецифическом иммунитете макрофаги могут уничтожать или переваривать патогены внутри клеток, мертвые клетки организма и другие крупные частицы антигенов посредством фагоцитоза. В специфическом иммунитете они могут играть роль в регуляции иммунитета и презентации антигенов. Есть данные исследований, что сапонины D из Platycodon grandiflorus и сапонины из Magnolia grandiflorus могут повышать фагоцитарную способность макрофагов мыши. В соответствии с предыдущими исследованиями, результаты этого эксперимента показывают, что RPFRS может увеличить значение OD фагоцитоза клеток RAW 264.7 нейтрального красного дозозависимым образом в концентрациях 12,5-200 мк г/мл (P<0,01), что указывает на то, что RPFRS может повысить фагоцитарную активность клеток RAW 264.7 и усилить их иммунную функцию.

Влияние РПФРС на секрецию NO и экспрессию мРНК iNOS в клетках RAW 264.7. Макрофаги могут уничтожать патогены, запуская иммунные воспалительные реакции, и помогают организму регулировать специфические иммунные реакции, а NO, синтезируемый синтазой оксида азота (iNOS), тесно связан с их функцией воспалительного иммунного ответа. Ян и др. обнаружили, что гидролизат белка женьшеня Panax может стимулировать клетки RAW 264 выделять NO и активировать макрофаги с помощью TNF - α, усиливая их иммунную активность. Результаты этого эксперимента показали, что по сравнению с пустой контрольной группой RPFRS может значительно увеличить содержание NO в супернатанте клеток RAW 264.7 (P<0,05), и в то же время экспрессия iNOS в клетках RAW 264.7 также значительно увеличивается (P<0,01), причем оба показателя имеют дозозависимое увеличение. Этот результат согласуется с данными Li et al. о том, что астрагалозид IV может повышать экспрессию NO и мРНК iNOS в супернатанте клеток RAW 264.7.
Влияние РПФРС на секрецию цитокинов и экспрессию мРНК в клетках RAW 264.7. Цитокины, такие как IL-6, IL-10, IL-1 β и TNF - α, в основном играют роль в местной и системной воспалительной реакции. IL-6 может индуцировать предшественников В-лимфоцитов превращаться в клетки, секретирующие антитела. IL-10, как противовоспалительный фактор, может подавлять активность макрофагов и воспалительных цитокинов, таких как IL-6 и TNF - α. IL-1 β может способствовать активации и дегрануляции макрофагов и нейтрофилов, а также экспрессии других воспалительных факторов. TNF α является основным провоспалительным цитокином, вырабатываемым макрофагами в ответ на различные стимулы, который может способствовать секреции таких цитокинов, как IL-6 и IL-8. Sun et al. обнаружили, что соевый сапонин Ab может повышать уровни TNF - α и IL-1 β в супернатанте клеток RAW 264.7. Ли и др. обнаружили, что астрагалозид IV может повышать уровень и экспрессию мРНК IL-6, IL-1 β и TNF - α в супернатанте клеток RAW 264.7. Результаты данного исследования показали, что по сравнению с группой холостого контроля RPFRS дозозависимо повышает уровни IL-6, IL-10, IL-1 β и TNF - α в супернатанте клеток RAW 264.7. RPFRS также в разной степени повышал уровни экспрессии мРНК IL-6, IL-10, IL-1 β и TNF - α в клетках RAW 264.7, что указывает на то, что RPFRS может регулировать их иммунную функцию путем стимуляции секреции цитокинов.
Влияние РПФРС на экспрессию белков, связанных с путем NF - κ B, в клетках RAW 264.7. NF - κ B, как ядерный транскрипционный фактор, может активировать экспрессию различных генов, связанных с ранними защитными реакциями, тем самым регулируя такие физиологические процессы, как апоптоз клеток, иммунный ответ, воспаление и ремоделирование тканей. Активация сигнального пути NF - κ B стимулируется различными сигнальными молекулами. TLR2 и TLR4, являющиеся членами семейства рецепторов распознавания образов, высоко экспрессируются на поверхности макрофагов, B-клеток и DC-клеток и могут отслеживать и распознавать связанные с болезнью молекулярные паттерны, чтобы инициировать трансдукцию сигнала в сигнальном пути. Последний также может стимулировать MyD88, чтобы запустить сигнальный каскад и вызвать активацию NF - κ B. MyD88 и TRIF связываются с TLR-связывающими белками в цитоплазме, активируют MAPK-путь под действием убиквитина, способствуют фосфорилированию I κ B - α для активации NF - κ B-пути и регулируют экспрессию генов ниже по течению. He et al. обнаружили, что после воздействия различных доз общих сапонинов из Platycodon grandiflorum уровни IL-6, IL-1 β и TNF - α в синовиальной ткани голеностопного сустава крыс с коллаген-индуцированным артритом снизились, а уровни TLR2, TLR4, MyD88 и других белков уменьшились. Shin et al. обнаружили, что термически обработанные гинзенозиды Rg1 и Rg3 могут способствовать секреции IL-6 и TNF - α в клетках RAW264.7, а также фосфорилированию MAPK и деградации I κ B - α для активации сигнального пути NF - κ B. Результаты эксперимента показали, что под действием РПФРС экспрессия мРНК TLR4 в клетках RAW 264.7 снизилась, в то время как экспрессия мРНК MyD88 и NF - κ B увеличилась; в соответствии с этим результаты ВБ показали снижение экспрессии TLR4, I κ B α и цитоплазматических NF - κ B белков, в то время как экспрессия TLR2, MyD88, TRIF и ядерных NF - κ B белков увеличилась, что указывает на транслокацию NF - κ B из цитоплазмы в ядро. После активации NF - κ B-пути он может обратить вспять индукцию транскрипции, опосредованную провоспалительными цитокинами, что соответствует результатам содержания цитокинов и экспрессии мРНК, приведенным выше. Это указывает на то, что RPFRS может активировать клетки RAW 264.7 через TLR2 и TLR4, опосредованные TRIF/MyD88-NF - κ B трансдукционным путем.
RPFRS может способствовать пролиферации клеток RAW 246.7, усиливать фагоцитарную активность, увеличивать содержание и экспрессию мРНК родственных цитокинов, снижать экспрессию мРНК TLR4, повышать экспрессию TLR2, MyD88, TRIF и ядерного NF - κ B белка, снижать экспрессию TLR4, I κ B - α и цитоплазматического NF - κ B белка, а также проявлять определенный дозовый эффект. RPFRS может оказывать иммунную защиту, ингибируя стимуляцию TLR4 под действием LPS, а также активировать клетки RAW 264.7 через сигнальный путь TLR2/4-MyD88/TRIF-NF - κ B, участвуя в процессе иммунного ответа и оказывая иммунорегулирующее действие. Необходимы дальнейшие исследования для изучения взаимосвязи между РПФРС и другими сигнальными путями, участвующими в иммунной регуляции клеток RAW 264.7, а также их компонентов и иммунной активности.