Скрининг ключевых генов и путей развития микрососудистых осложнений при диабете и прогнозирование традиционной китайской медицины с помощью методов биоинформатики
В последние годы эпидемиологические исследования, связанные с диабетом, показывают, что частота гипергликемии среди людей старше 18 лет в Китае достигла 11,2%, и заболеваемость диабетом продолжает расти. Диабет представляет собой сложное нарушение обмена глюкозы в крови. На определенном этапе течения заболевания могут возникать различные острые и хронические осложнения хронической гипергликемии. Хроническая гипергликемия и генетическая предрасположенность в конечном итоге влияют на состояние микрососудов, приводя к осложнениям в первую очередь со стороны почек, глаз и нервной системы. Классические микрососудистые осложнения диабета включают диабетическую нефропатию (ДН), диабетическую ретинопатию (ДР) и диабетическую нейропатию (ДПН). ДКД является основной причиной болезни почек в конечной стадии (ESRD), уступая лишь различным видам гломерулонефрита. ДР - распространенный фактор, влияющий на зрение и даже слепоту, а ДПН - важный фактор высокого риска развития язв стопы и последующих ампутаций. Эти три микрососудистых осложнения серьезно влияют на здоровье пациентов с диабетом и являются серьезным экономическим бременем для пациентов и общества. Однако современная медицина не до конца понимает специфику патогенеза микрососудистых осложнений диабета, и трудно добиться хороших результатов с помощью простой западной медицины при лечении микрососудистых осложнений диабета со сложными механизмами. Традиционная китайская медицина имеет многовековую историю, и ее клиническая эффективность подтверждена в течение длительного периода времени, особенно в лечении некоторых хронических заболеваний. Традиционная китайская медицина подчеркивает целостную концепцию и единство Неба и человека. В клиническом лечении особое внимание уделяется дифференциации и лечению синдромов. По сравнению с однокомпонентной западной медициной, традиционная китайская медицина может лечить сложные и разнообразные заболевания человека за счет интеграции и регулирования множества связей, уровней и целей. Однако систематического объяснения механизмов не хватает. Поэтому необходимо продолжить изучение микрососудистых осложнений диабета, чтобы получить патофизиологические механизмы, связанные с развитием и прогрессированием заболевания, и изучить потенциальные терапевтические препараты китайской медицины.

С быстрым развитием биоинформатики эффективное использование большого количества чипов экспрессии генов и данных высокопроизводительного секвенирования для поиска и анализа больших данных в клинических образцах может помочь изучить патогенез заболеваний и предоставить больше рекомендаций для клинической практики. В этом исследовании мы использовали высокопроизводительное секвенирование для загрузки данных чипа профиля экспрессии генов по микрососудистым осложнениям диабета из базы данных GEO для анализа, провели скрининг DEGs между долгосрочным плохим гликемическим контролем с тяжелыми микрососудистыми осложнениями и долгосрочным плохим гликемическим контролем без микрососудистых осложнений, Анализ функции и обогащения путей DEGs, анализ взаимодействия между белками, дальнейший скрининг ключевых целевых молекул и потенциальных китайских лекарств, участвующих в патогенезе микрососудистых осложнений диабета, и предоставление новых подсказок для клинической диагностики, лечения и профилактики.

 

Диабет - это группа метаболических и гетерогенных заболеваний, которые могут быть вызваны генетическими, экологическими и другими факторами. У большинства пациентов с диабетом на определенном этапе течения заболевания возникают серьезные осложнения хронической гипергликемии, включая заболевания почек, ретинопатию, нейропатию и сердечно-сосудистые заболевания. В настоящее время нет единого мнения о патогенезе микрососудистых осложнений, что приводит к появлению таких гипотез, как гемодинамические нарушения, неферментативное гликозилирование белков, повышенная активность полиоловых каналов, самоокисление тканей и гликозилирование. В клинической практике мы обнаружили, что, хотя сахар крови плохо контролируется в течение длительного времени, некоторые пациенты с диабетом все еще свободны от микрососудистых осложнений. Изучение патогенеза микрососудистых осложнений при диабете и прогнозирование соответствующих традиционной китайской медициной путем анализа разницы между длительным плохим гликемическим контролем с тяжелыми микрососудистыми осложнениями и длительным плохим гликемическим контролем без микрососудистых осложнений, чтобы дать новые подсказки для клинической профилактики и лечения.

Используя GEO2R для анализа и обработки набора данных GSE43950, было получено 692 ДГЭ, включая 121 ген с повышенной экспрессией и 571 ген с пониженной экспрессией. В результате анализа обогащения GO-функций и сигнальных путей KEGG в DGEs с использованием базы данных DAVID было установлено, что повышающиеся дифференциально экспрессированные гены в основном участвуют в регуляции гемостаза и коагуляции крови и связаны со специфическим связыванием ДНК с основными промоторными последовательностями и сигнальным путем NF - κ B, сигнальным путем AGE-RAGE, сигнальным путем MAPK и т.д. Даунрегуляция дифференциально экспрессируемых генов в основном вовлечена в иммунный ответ при активации нейтрофилов, сигнальный путь NOD-подобных рецепторов, сигнальный путь толл-подобных рецепторов, эндоцитоз и другие связанные процессы. Проведя исследование, мы обнаружили, что некоторые функции обогащения и сигнальные каналы дифференциальных генов связаны с процессом развития микрососудистых осложнений при диабете. Например, сигнальный путь MAPK и сигнальный путь AGE-RAGE в анализе обогащения сигнальных путей KEGG, которые повышают регуляцию DEGs, тесно связаны с процессом заболевания диабетом и его микрососудистыми осложнениями. Путь MAPK имеет четыре основных разветвления: ERK, JNK, p38/MAPK и ERK5. При диабете и его поздних осложнениях активность MAPK в организме повышена, что не имеет никакого отношения к метаболическому контролю. Высокий уровень сахара в крови может активировать MAPK-путь и играть важную роль в опосредовании поздних осложнений. Путь MAPK тесно вовлечен в прогрессирование заболевания ДР. Ингибирование сигнальных путей p38 и ERK позволяет уменьшить повреждения, вызванные окислительным стрессом, что эффективно задерживает дальнейшее развитие ДР. P38/MAPK опосредует возникновение диабетической нефропатии, которая может способствовать выработке реактивных форм кислорода (ROS), опосредовать высвобождение медиаторов воспаления, активировать систему RAS, повышать гломерулярное внутреннее давление и ускорять прогрессирование заболевания ДКД. Роль сигнального пути "конечные продукты прогрессивного гликирования" (AGE) - AGE-рецептор (RAGE) недавно была определена в патогенезе целого ряда процессов, таких как воспаление, злокачественные опухоли, диабет и осложнения диабета, нейродегенерация. Последние исследования показали, что взаимодействие AGE и рецепторов RAGE вызывает окислительные и проапоптотические реакции в различных типах клеток и участвует в патогенезе сосудистых осложнений при диабете. AGE приводит к осложнениям диабета через два механизма: первый заключается в том, что он сшивается в биомолекулах, изменяя их биологическую структуру и функцию; второй - в том, что он связывается с соответствующими рецепторами на поверхности клеток, такими как RAGE, чтобы стимулировать сигнальный путь, ведущий к ухудшению окислительного стресса. По сравнению со здоровыми людьми у пациентов с диабетом наблюдается более высокая концентрация AGE и продуктов окисления глюкозы, которые, как считается, усиливают окислительный стресс за счет взаимодействия с их рецепторами (RAGE), способствуя тем самым развитию сосудистых осложнений.

DEGs в основном обогащены в областях, связанных с гемостазом крови, регуляцией коагуляции, иммунным ответом на активацию нейтрофилов и апоптозом клеток. Для анализа DEGs использовались база данных белковых взаимодействий STRING и cytoHubba в программе Cytoscape, в результате чего были получены Top10 ключевых генов. Ключевые гены, такие как IL1B, TLR2, TLR4 и CYBB, опосредуют иммунную регуляцию организма на нескольких уровнях, что позволяет предположить, что процесс иммунной регуляции является важным звеном в возникновении и развитии микрососудистых осложнений при диабете, а регуляция иммунной функции организма может стать важной целью для профилактики и лечения микрососудистых осложнений при диабете.

ИЛ-1В, как ключевой провоспалительный фактор семейства цитокинов интерлейкина-1, является основным регулятором воспалительной реакции и участвует в ряде клеточных действий, таких как пролиферация, дифференцировка и апоптоз. Он также связан с болью и аутоиммунными реакциями в организме. Исследования показали, что IL-1B является ключевой молекулой, инициирующей воспаление поджелудочной железы при развитии T2DM. Большое количество экспериментальных исследований показало, что активация воспалительных органов и секреция ИЛ-1В являются ключевыми процессами, способствующими формированию атеросклероза. Провоспалительные цитокины ИЛ-1В, интерлейкин-6 (ИЛ-6) и интерлейкин-8 (ИЛ-8) являются медиаторами острофазового ответа, обычно связанного с индукцией окислительного стресса. Окислительный стресс, являясь общим путем опосредования осложнений диабета, опосредует многие поздние осложнения диабета, включая микрососудистые осложнения и макроангиопатию диабета.
TLR относятся к семейству рецепторов распознавания образов и тесно связаны с развитием диабета. TLR могут активировать врожденную иммунную систему и связаны с патогенезом инсулинорезистентности, диабета и атеросклероза, особенно экспрессия TLR2 и TLR4. TLR2 в основном экспрессируется в клетках с иммунными функциями, таких как дендритные клетки, моноциты и некоторые эндотелиальные клетки. Он участвует в патогенезе ДН, регулируя цитокиновый сигнальный путь в организме. Шао и др. изучали влияние паэонифлорина на почки мышей с диабетом 1 типа, используя нокаутных мышей TLR2 и однопометников дикого типа. Было обнаружено, что при ингибировании сигнального пути TLR2 альбуминурия у мышей с диабетом значительно снижается, а гистопатология почек ослабевает, что подтверждает тесную связь TLR2 с ДН. Между тем, TLR2 является медиатором дегенерации сетчатки в ответ на окислительный стресс, служа мостом между окислительным повреждением и комплемент-опосредованным поражением сетчатки, что может свидетельствовать о тесной связи между TLR2 и возникновением диабетической ретинопатии. В семействе TLRs TLR4, являясь трансмембранным белковым рецептором, отвечает за активацию многих путей передачи сигнала. Считается, что хроническое воспаление при диабете связано с активацией TLR4. По данным Aly и других исследований, повышенная экспрессия TLR2 и TLR4 может играть важную роль в прогрессировании ДН и ухудшении инсулинорезистентности у пациентов с диабетом 2 типа. Таким образом, TLR2 и TLR4 из семейства TLRs могут быть перспективной терапевтической мишенью для профилактики или задержки развития диабета 2 типа и его осложнений.
CYBB кодирует gp91phox, который является важным компонентом NADPH-оксидазы в фагоцитирующих клетках и основным источником окислительного стресса в почках. CYBB опосредует выработку ROS и участвует в клеточной сигнализации, связанной с дифференцировкой, клеточным циклом и апоптозом. Как на больных диабетом, так и на животных моделях было подтверждено, что патогенез СД может быть опосредован выработкой ROS в условиях окислительного стресса (ОС) организма. Избыток ROS рассматривается как основной механизм развития осложнений диабета. Увеличение продукции митохондриальных ROS играет важную роль в развитии осложнений диабета (в том числе ретинопатии).
Путем сопоставления ключевых генов с базой данных по медицине и создания сети целевых компонентов активных ингредиентов лекарств было установлено, что четыре наиболее часто встречающихся традиционных китайских лекарственных средства (scutellaria baicalensis, salvia miltiorrhiza, achyranthes bidentata и yujin) и их активные ингредиенты могут воздействовать на ключевые гены, которые влияют на микрососудистые осложнения диабета. Все четыре традиционных китайских препарата обладают определенным эффектом, способствующим циркуляции крови и устранению ее застоя. Salvia miltiorrhiza и yujin - наиболее часто используемые в клинической практике препараты для стимулирования кровообращения и устранения застоя крови, и они идеально соответствуют патогенезу "диабет переходит в коллатерали после длительной болезни, а застой крови возникает после длительной болезни". В ТКМ диабет называется "сяокэ". Его патогенез основан на дефиците инь и характеризуется сухостью и жаром. Длительное утоление жажды может легко вовлечь в процесс множество органов, нарушая нормальную работу ци и крови, вызывая дефицит инь, сухость и жар, расходуя жидкости в организме, что приводит к нарушению кровообращения и застою крови. Застой крови является важным звеном патогенеза диабета, который связан с прогрессированием различных хронических осложнений. В клинической практике для лечения осложнений, связанных с диабетом, часто используются китайские растительные препараты, способствующие улучшению кровообращения и устранению застоя крови. Современная фармакология также доказала, что некоторые компоненты вышеупомянутых традиционных китайских лекарств играют важную роль в лечении диабета и микрососудистых осложнений. Было установлено, что многочисленные биологически активные препараты, выделенные из корня Scutellaria baicalensis, такие как байкалеин и байкалин, повышают потребление глюкозы и снижают уровень сахара в крови. Таншинон IIA - классический активный ингредиент Даньшэна, обладающий противовоспалительным, антиоксидантным и антифибротическим действием. Таншинон IIA может улучшить болевую невропатию при диабете, ингибируя экспрессию и активность натриевых каналов вольтажного типа в дорсальных корешковых ганглиях крыс, что позволяет предположить, что таншинон IIA может быть перспективным препаратом для лечения ДПН. Юань и др. обнаружили, что таншинон IIA может улучшать липидный обмен, метаболизм глюкозы и резистентность к инсулину у крыс с диабетом 2 типа через сигнальный путь AMPK, индуцированный NF - κ B. Куркумин является основным активным ингредиентом куркумы. Систематический обзорный анализ показал, что куркумин обладает способностью подавлять окислительный стресс и воспалительные процессы в организме. Нанокуркумин, созданный на основе нанотехнологий, рассматривается как потенциальный препарат для медикаментозного лечения и ведения больных диабетом. β - экдистерон в основном отвечает за один из активных ингредиентов в Achyranthes chuanxiong, который может снижать уровень сахара в крови, стабилизировать уровень метаболитов NO в организме и, таким образом, защищать почки.

С помощью технологии поиска информации на основе биоинформатики был проведен анализ различий в генах между длительным плохим гликемическим контролем с тяжелыми микрососудистыми осложнениями и длительным плохим гликемическим контролем без микрососудистых осложнений, и были отобраны 10 генов с наибольшими различиями. Дальнейший анализ показал, что такие гены, как IL1B, TLR2, TLR4 и CYBB, играют важную роль в развитии микрососудистых осложнений при диабете, а традиционные китайские препараты, такие как шалфей лекарственный, скутеллария байкальская, куркума и ахирантес двузубый, и их активные ингредиенты могут стать новыми препаратами для лечения микрососудистых осложнений при диабете, что дает новые идеи для дальнейшего изучения молекулярного механизма микрососудистых осложнений при диабете и поиска новых терапевтических препаратов. Однако данное исследование все же имеет следующие недостатки. Во-первых, размер выборки в этой исследовательской базе данных невелик, а типы диабета не дифференцированы, поэтому необходимо дальнейшее расширение выборки и уточнение классификации диабета; во-вторых, не хватает точных экспериментальных исследований и проверки. Поэтому необходимо продолжить изучение функции этих ключевых целевых молекул и потенциальных лекарств в микрососудистых осложнениях диабета.