Прогнозирование целевого назначения традиционной китайской медицины по дифференциальным генам и иммунному механизму инвазии при раке поджелудочной железы на основе биоинформационного скрининга
За последние 25 лет глобальное бремя аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC) увеличилось более чем в два раза, и ожидается, что к 2030 году она станет второй основной причиной смертности от рака. Средняя пятилетняя выживаемость пациентов с PDAC составляет всего 8%, и до 71% пациентов сталкиваются с риском рецидива даже после полной хирургической резекции. Такая характеристика опухоли, как высокая летальность и высокая частота рецидивов, обусловлена плотным матричным компонентом (физическим барьером) РПЖ, который препятствует проникновению иммунных эффекторных клеток в опухоль и позволяет клеткам рака поджелудочной железы избегать иммунного контроля. В настоящее время во многих клинических исследованиях предпринимаются попытки повысить общую эффективность лечения больных РПЖ с помощью иммунотерапии, включая ингибиторы иммунных контрольных точек, противораковые вакцины, адоптивное клеточное метастазирование и др. Клиническая эффективность терапии моноклональными антителами невысока, и прорыва в этой области не произошло.

С появлением высокопроизводительного генетического анализа профилирование экспрессии генов стало эффективным методом выявления дифференциально экспрессируемых генов при различных заболеваниях. CIBERSORT - это аналитический инструмент, который использует данные микрочипов или секвенирования РНК для оценки экспрессии иммунных клеток в образце и получения различных соотношений иммунных клеток. Несмотря на то, что было проведено множество биоинформатических анализов дифференциально экспрессированных генов в PDAC, не хватает дальнейших углубленных исследований иммунных механизмов и предсказания терапевтических мишеней, особенно с точки зрения терапевтического потенциала травяной медицины. Традиционная китайская медицина сформировала систематическое представление о таких распространенных заболеваниях, как желтуха и асцит, связанных с РПЖ. В то же время традиционная китайская медицина, обладая естественным преимуществом мультицелевого воздействия, может эффективно вмешиваться в сложные иммунные микросреды, что заслуживает дальнейшего изучения. Поэтому в данном исследовании использовалась база данных Gene Expression Omnibus (GEO) для отбора парных образцов тканей пациентов с РПЖ для корреляционного анализа. Механизм заболевания был изучен на генетическом уровне, проведены анализ различий в выживаемости и анализ иммунных показателей. Алгоритм деконволюции CIBERSORT использовался для отображения картины инфильтрации иммунных клеток в тканях PDAC. Наконец, были проведены всесторонний прогноз и скрининг потенциально эффективных традиционных китайских лекарств, что послужило основой для выбора и разработки клинических препаратов.

В настоящее время иммунотерапия рака поджелудочной железы достигла определенных успехов, что дало надежду на клиническое лечение рака поджелудочной железы. Однако из-за того, что микроокружение рака поджелудочной железы обычно включает иммуносупрессивную клеточную пролиферацию, инактивацию иммунных клеток и низкую мутационную нагрузку опухоли, большинство результатов иммунотерапии не являются удовлетворительными. С развитием высокопроизводительных технологий Lv et al. использовали множество наборов данных для поиска дифференциальных генов ядра рака поджелудочной железы, Xiao et al. использовали дифференциальные гены "рака воспаления" для поиска традиционной китайской медицины и т.д., все они углубили понимание молекулярного механизма рака поджелудочной железы. Однако работ, посвященных иммунным механизмам этого заболевания, недостаточно, что не способствует улучшению прогноза выживаемости пациентов в долгосрочной перспективе. Поэтому в данном исследовании впервые проводится дальнейшее изучение соответствующих механизмов иммунной инфильтрации и потенциально эффективных средств традиционной китайской медицины на основе дифференциальных генов с целью улучшения механизмов и содействия разработке лекарственных препаратов. Во-первых, в данном исследовании были отобраны подходящие генные чипы в базе данных GEO и проведено сравнение профилей экспрессии генов в образцах опухоли поджелудочной железы и нормальной ткани одного и того же пациента, в результате чего было получено 2653 дифференциально экспрессированных гена. Основные дифференциально экспрессированные гены были определены с помощью PPI, включая гены, связанные с тканями внеклеточного матрикса и коллагеновыми волокнами (COL1A2, COL1A1, COL3A1, COL5A1, COL5A2), металлопептидазу ADAM (ADAMTS2), полисахарид подвальной мембраны (LUM), субъединицу интегратина альфа 2 (ITGA2), фибронектин (FN1) и матриксную металлопротеиназу (MMP2). Было доказано, что вышеперечисленные дифференциально экспрессируемые гены повышены в опухолевых тканях, связаны с метаболизмом коллагена и в основном принадлежат к семействам COL1, COL3 и COL5. Среди них экспрессия COL1A2 была подтверждена как самая высокая в ткани методом qRT PCR, что указывает на высокую достоверность данного результата. В отличие от других солидных опухолей, микроокружение опухоли при PDAC представляет собой плотную матричную среду, содержащую панкреатические стеллатные клетки, фибробласты, связанные с раком, иммунные клетки и чрезмерный фиброз внеклеточного матрикса. Плотный фиброзный ответ в матриксе и изменения в иммунной среде опухоли считаются основными причинами текущих неудач в лечении PDAC. Дальнейший анализ выживаемости показал, что эти основные дифференциально экспрессируемые гены значительно коррелируют с показателем RFS у пациентов с РПЖ и положительно коррелируют со степенью инфильтрации различных опухолевых клеток, что позволяет предположить, что эти гены могут опосредовать клинический прогноз пациентов с РПЖ путем изменения иммунного микроокружения опухоли. Как использовать этот момент для изменения клинических исходов, становится одним из возможных прорывов.
Дальнейший анализ GO и KEGG обогащения дифференциально экспрессированных генов позволяет предположить, что их биологические процессы связаны с дегрануляцией нейтрофилов, миграцией, хемокинами, дифференцировкой Т-хелперных клеток, гуморальным иммунным ответом и другими процессами. Микроокружение РПЖ по сути своей является воспалительным, и тот факт, что хемокины и другие факторы способствуют развитию воспалительного микроокружения опухолей, также доказан. Помимо цитокинов и хемокинов, активация нейтрофилов часто является первым молекулярным событием, за которым следует миграция в опухолевую ткань. Очевидно, что раковые клетки PDAC могут рекрутировать полиморфноядерные нейтрофилы в окрестности опухоли, но большинство из них не способны вызывать противоопухолевый ответ. Как правило, высокое содержание нейтрофилов способствует прогрессированию РПЖ и связано с плохим прогнозом; недавние эксперименты in vitro показали, что раковые клетки поджелудочной железы вызывают образование внеклеточных ловушек нейтрофилов, тем самым способствуя возникновению микрометастазов РПЖ в печень; в то же время локальная гипоксия, вызванная высоким фиброзом, определяет иммунную среду, а постоянное выделение реактивных видов кислорода приводит к локальной гипоксии, усиливая тем самым инфильтрацию нейтрофилов. Таким образом, нейтрофилы имеют решающее значение в микроокружении рака поджелудочной железы. Кроме того, результаты этого исследования позволяют предположить, что дифференциально экспрессируемые гены непосредственно участвуют в дифференцировке Т-клеток и регуляции гуморального иммунитета.

Для дальнейшего изучения роли иммунной инфильтрации в патогенезе РПЖ в данном исследовании использовался метод деконволюции CIBERSORT для анализа всех опухолевых образцов. По сравнению с нормальной тканью поджелудочной железы в опухолевой ткани значительно увеличилось количество макрофагов М2 и CD4+T-клеток с памятью покоя, а CD8+T-клеток - значительно уменьшилось. Такая же тенденция наблюдалась и в парных образцах. М2-макрофаги продуцируют противовоспалительные сигналы, способствующие прогрессии опухоли, что подтверждено как один из показателей плохого прогноза рака поджелудочной железы. В 2013 году в исследовании, посвященном изучению степени инфильтрации иммунными клетками больных РПЖ с помощью ИГХ, было показано, что более высокий уровень инфильтрирующих опухоль пан-макрофагов M2, Tregs и CD4+T достоверно ассоциируется с более короткой выживаемостью. На мышиной модели РПЖ было продемонстрировано, что опухоль-ассоциированные макрофаги опосредуют иммунную супрессию и ангиогенез, выделяя цитокины, протеазы и факторы роста, и способствуют прогрессии опухоли. Кроме того, было показано, что ингибирование CCR2 повышает эффективность химиотерапии, препятствует метастазированию, повышает эффективность лучевой терапии и увеличивает иммунную инфильтрацию Т-клеток, блокируя рекрутирование моноцитов в микроокружение опухоли. Таким образом, макрофаги с большой вероятностью могут стать потенциальными мишенями для новых терапевтических стратегий в отношении РПЖ человека. Ранее считалось, что иммуносупрессивное микроокружение РПЖ, состоящее из фибробластов и фибробластов, ограничивает инфильтрацию Т-клеток, однако последние исследования выявили специфическое пространственное распределение Т-клеток, так как корреляционная тепловая карта показывает, что существует значительная отрицательная корреляция между CD4+Т-клетками памяти покоя и CD8+Т-клетками в ткани рака поджелудочной железы (r=-0,64), что было доказано как один из показателей плохого прогноза, особенно РПЖ. Инфильтрация CD8+T-клеток в опухолевой ткани тесно связана с количеством опухолевых клеток и выживаемостью пациентов. В последнее время ученые подчеркивают, что для создания успешного иммунитета у выживших пациентов требуется высокая численность CD8+T-клеток в опухоли. Понимание движущих факторов CD8+T-клеток и механизма инфильтрации CD8+T-клеток имеет решающее значение для дальнейшей разработки планов лечения PDAC. В настоящее время отсутствует крупномасштабное подтверждение связи между иммунными инфильтрирующими клетками РПЖ, и это предсказание имеет определенное справочное значение.
РДАК в традиционной китайской медицине относится к категориям "скопление селезенки", "целевая ци", "накопление", "застой ци" и "фу лянь". Результаты литературных исследований серий случаев и мета-анализа свидетельствуют о том, что комбинированное лечение традиционной китайской медициной при РПЖ может эффективно снизить смертность пациентов и улучшить долгосрочный прогноз. Последние фундаментальные исследования показали, что механизм действия традиционной китайской медицины при лечении РПЖ в основном заключается в улучшении микроокружения опухоли, что косвенно улучшает результаты лечения. Поэтому изучение иммунного микроокружения опухоли имеет решающее значение для поиска эффективных средств традиционной китайской медицины. В настоящее время в традиционной китайской медицине патогенез РДАК в основном рассматривается как "недостаток происхождения, но избыток сущности", с акцентом на накопление влажного тепла и токсинов. Однако в данном исследовании прогнозируется, что эффективность традиционной китайской медицины в основном относится к категории жаропонижающих средств (Scutellaria baicalensis, Sagittaria angustifolia, кора пиона, пурпурная трава и т.д.), за которыми следуют тонизирующие препараты (женьшень, эвкоммия ульмоидес, лимонник, панцирь черепахи, клей для шкур задницы и т.д.), что согласуется с патогенезом традиционной китайской медицины. С точки зрения локализации заболевания, по сравнению с описаниями анатомического расположения и физиологических функций в древних книгах по китайской медицине, большинство ученых поддерживают отнесение поджелудочной железы к селезенке среди пяти органов. Однако данное исследование показывает, что подавляющее большинство эффективных предсказаний традиционной китайской медицины относится к меридиану печени, за которым следуют меридианы легких и почек, что позволяет предположить, что, возможно, лечение влажного жара по теории печени в сочетании с оказанием помощи при дефиците селезенки может еще больше повысить эффективность лечения. После проведенного поиска было установлено, что эта теория имеет разрозненный опыт и обзорные отчеты и заслуживает дальнейшего изучения для формирования систематического понимания. Кроме того, в данном исследовании использовалось обратное предсказание для получения нескольких традиционных китайских лекарств. Среди очередей китайских лекарств с высокой корреляцией было обнаружено, что гинзенозиды могут уменьшить ангиогенез и питание опухолевых клеток путем снижения экспрессии MMP2 и других факторов; Куркумин ингибирует самообновление стволовых клеток PDAC через активность сигнального пути Wnt/β - Catenin и может улучшить локальную микроциркуляцию в ткани модели опухоли PDAC при подкожной трансплантации, увеличить кровоснабжение и кислород в микроокружении опухоли и ингибировать гипоксический стрессовый ответ опухолевых клеток и стромальных клеток; Приведенные выше литературные данные подтверждают некоторые из прогнозируемых результатов данного исследования, но по-прежнему не хватает исследований иммунных механизмов, связанных с лечением PDAC традиционной китайской медициной.
В данном исследовании учитывались индивидуальные различия в анализе иммунных механизмов при скрининге генных чипов, а также проводилась тщательная проверка экспериментальных данных PDAC с использованием анализа парных образцов. В то же время, учитывая, что данное исследование по сути является вторичным анализом предыдущих единичных данных GSE, для проверки экспрессии основных дифференциально экспрессируемых генов использовались различные уровни, что позволило снизить риск. Тем не менее, данное исследование все еще имеет следующие недостатки: (1) из-за небольшого размера выборки анализ данных имеет определенную погрешность, и на более позднем этапе для анализа будет включено больше наборов данных, отвечающих требованиям; (2) анализ алгоритма деконволюции CIBERSORT основан на ограниченных генетических данных, которые могут отклоняться от клеточных гетеротипических взаимодействий, факторов, вызывающих заболевания, и пластичности фенотипов заболеваний. Клинические и фундаментальные исследования могут более полно и объективно отразить индивидуальный иммунный статус. Таким образом, в данном исследовании впервые использованы методы биоинформатики в сочетании с алгоритмом деконволюции CIBERSORT для изучения механизма иммунной инфильтрации при РПЖ и прогнозирования потенциально эффективных традиционных китайских лекарств, что имеет определенное значение для будущих исследований в этой области.