Исследование антиоксидантного и противовоспалительного действия этилацетата в листьях гибискуса и HRMS-анализ UPLC-Q-Orbitrap
Листья Hibiscus mutabilis - это высушенные листья Hibiscus mutabilis L., растения семейства Мальвовые (Malvaceae). Они включены в издание Китайской фармакопеи 2020 года и производятся в основном в Сычуани, Хунани, Гуандуне, Юньнани и других регионах Китая. Ци мягкая, вкус резкий и плоский, обладает эффектами охлаждения крови, детоксикации, уменьшения отеков и снятия боли. В "Шэньнун бэнькао цзин" записано: "С ци конца лета и начала осени, он имеет резкий вкус и относится к категории Цзинь Хуа, которая может очистить легкие. Его ци спокойна и прохладна, что позволяет охлаждать кровь, отводить тепло, выводить токсины и лечить все виды карбункулов, отеков, токсинов и язв, а также избавлять от гноя и болей и детского недоедания". Современные фармакологические исследования показали, что Mufu Rong Ye обладает хорошим антибактериальным, противоинфекционным и противовирусным действием, а также оказывает защитное действие при ишемии-реперфузии почек и хроническом повреждении печени. Основные химические компоненты листьев гибискуса включают флавоноиды, органические кислоты, фенолы, аминокислоты, дубильные вещества, сахара, стероиды и летучие масла.
Исследовательская группа предварительно определила, что этилацетатная фракция листьев гибискуса обладает хорошей антиоксидантной активностью, основываясь на показателях поглощения свободных радикалов DPPH и ABTS. Флавоноиды могут быть одним из фармакологических веществ листьев гибискуса. Однако химические методы in vitro не могут точно отразить истинную роль активных веществ в организме. Поэтому в данном исследовании была создана модель окислительного стрессового повреждения клеток HaCaT, вызванного H2O2, измерено производство реактивных видов кислорода (ROS), изучено защитное действие различных полярных частей листьев гибискуса на окислительное стрессовое повреждение клеток HaCaT, создана модель воспаления клеток RAW 264.7, вызванного LPS, измерена степень ингибирования экспрессии факторов воспаления клетками этилацетатной части, и далее изучено антиоксидантное и противовоспалительное действие на клеточном уровне. На основе технологии UPLC-Q-Orbitrap HRMS был определен химический состав этилацетатной части листьев гибискуса, а точный анализ активных частей показал, что основными компонентами этилацетатной части являются флавоноиды и их гликозиды. Цель данного исследования - всесторонне объяснить фармакологическую основу листьев гибискуса. Обеспечить научную основу для его разработки и использования.

ROS является продуктом клеточного окислительного метаболизма, и его чрезмерное увеличение или длительное присутствие может вызвать окислительное повреждение клеток. H2O2 может индуцировать выработку избыточного количества ROS, что делает его идеальным индуктором в моделях повреждений, вызванных окислительным стрессом. Клетки HaCaT легко получить, они легко адаптируются и стабильны. Использование H2O2 для создания моделей окислительного стрессового повреждения клеток HaCaT является распространенной клеточной моделью для оценки антиоксидантной активности. TNF - α, IL-6, iNOS и COX-2 - типичные факторы воспаления, LPS - распространенный провоспалительный фактор, а макрофаги - важные участники воспалительного ответа, опосредующие развитие различных иммунопатологических процессов при воспалении. Использование ЛПС для индуцирования клеток RAW 264.7 является классической клеточной моделью для изучения факторов воспаления. В настоящее время эти два метода признаны в опубликованных групповых стандартах в качестве доказательств, подтверждающих наименование косметических средств по их антиморщинному и успокаивающему действию. В данном исследовании была создана модель окислительного повреждения клеток HaCaT и установлено, что этилацетатная фракция различных полярных частей листьев гибискуса обладает сильной антиоксидантной активностью. В диапазоне концентраций 25-200 мк г/мл этилацетатная фракция листьев гибискуса значительно снижала содержание ROS (P<0,001), ослабляла окислительный стресс и оказывала хорошее защитное действие на модель окислительного повреждения клеток; Далее было проведено исследование противовоспалительного действия этилацетатного экстракта листьев Hibiscus syringae и создана модель воспаления клеток RAW264.7. При концентрации этилацетатного экстракта 200 мк г/мл он значительно подавлял экспрессию TNF - α, IL-6, iNOS и COX-2 мРНК в клетках RAW 264.7 (P<0.001), демонстрируя хорошую противовоспалительную активность. Это позволило выяснить антиоксидантные и противовоспалительные активные участки листьев Hibiscus syringae, что создает теоретическую основу для дальнейших исследований фармакологической активности и разработки косметических средств.

Технология сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии с квадрупольной орбитальной ловушкой высокого разрешения подходит для анализа сложных многокомпонентных систем в традиционной китайской медицине и обладает такими характеристиками, как высокое разрешение, высокая точность качества и высокая эффективность обнаружения. В данном исследовании впервые использовалась технология UPLC-Q-Orbitrap HRMS для всестороннего качественного анализа сложных компонентов в эффективных частях этилацетата в листьях гибискуса. Было идентифицировано 28 химических компонентов, в том числе 10 флавоноидов, в основном рутин, нарингин, изокверцитрин и т.д.; 9 органических кислот, в основном феруловая, кофейная, салициловая и т.д.; также кумарины, фенолы, нуклеозиды, по 2 и 3 других компонента, что соответствует данным о том, что листья гибискуса богаты флавоноидами и фенольными кислотами. Флавоноиды содержат фенольные молекулы водорода, которые могут выступать в качестве доноров водорода, что делает их сильными антиоксидантами с отличной противовоспалительной активностью. Рутин может повышать активность каталазы (КАТ) и супероксиддисмутазы (СОД) в моделях болезни Паркинсона (БП); липа серебристая может ингибировать выработку простагландина Е2 (ПГЕ2) и активацию NF - κ B и сигнальных путей MAPK; Кверцетин может ингибировать ROS-опосредованный рак печени путем повышения уровня таких ферментов, как SOD и CAT, а также неферментативных систем антиоксидантной защиты, таких как глутатион (GSH); Изокверцетин может увеличить SOD и снизить уровень MDA, ингибировать сигнальный путь MEK/ERK и подавить реакцию окислительного стресса. За исключением азелаиновой кислоты, все компоненты органических кислот являются фенольными кислотами. Многочисленные исследования показали, что фенольные кислоты обладают сильными восстановительными свойствами благодаря полифенольным гидроксильным группам в их молекулярной структуре, что делает их типичным классом соединений с эффектом поглощения свободных радикалов. Например, феруловая кислота может повышать антиоксидантную способность сыворотки крови мышей и улучшать негативное влияние антибиотиков на метаболизм кишечника и воспалительную реакцию у мышей; салициловая кислота может вызывать повышение активности антиоксидантных ферментов и облегчать биологическое окисление реактивных видов кислорода. Данное исследование показало, что эти два типа компонентов являются основными химическими компонентами этилацетата листьев гибискуса, что свидетельствует о том, что основу фармакологических веществ листьев гибискуса, оказывающих антиоксидантное и противовоспалительное действие, составляют в основном флавоноиды и органические кислоты. В то же время в ходе исследования был обнаружен новый флавоноидный компонент в листьях Hibiscus syringae, о котором ранее не сообщалось, - глюкозид трифолиата, два новых фенольных компонента - 4-нитрофенол и 4-нитрокатехол, один новый нуклеозидный компонент - аденин, и два новых альдегидных компонента - 2,5-дигидроксибензальдегид и ванилин, что обогащает библиотеку химического состава листьев Hibiscus syringae.

Таким образом, этилацетатный экстракт листьев Hibiscus syringae может значительно облегчить клеточное окислительное повреждение, противостоять реакции окислительного стресса и подавлять экспрессию воспалительных факторов. Флавоноиды и органические кислоты могут быть основой его фармакологических веществ, обеспечивая теоретическую основу для дальнейших исследований антиоксидантных и противовоспалительных механизмов листьев Hibiscus syringae, а также разработки и использования натуральных продуктов.