Изучение процесса инкрементного обогащения гуперзина А методом симбиотического культивирования
Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) - папоротниковое растение семейства Taxaceae, принадлежащее к роду Taxodium. Это редкое китайское травяное лекарство, используемое для лечения травматических повреждений, детоксикации, снятия боли и лечения шизофрении. В настоящее время пихта змеиная является одним из наиболее изученных препаратов для лечения болезни Альцгеймера. Ее активный компонент, гуперзин А, является эффективным, малотоксичным, обратимым и высокоселективным ингибитором ацетилхолинэстеразы (АХЭ) для лечения миастении гравис и болезни Альцгеймера. Он способен усиливать действие ацетилхолина, нейромедиатора центральной нервной системы, связанного с вниманием, бдительностью, концентрацией и памятью. В 1982 году гуперзин А был успешно выделен из змеиной лапки и был назван "звездой надежды". По данным исследования, к 2025 году число пациентов с болезнью Альцгеймера в возрасте 65 лет и старше в развитых странах достигнет 7,1 миллиона человек, что почти на 29% больше, чем 5,5 миллиона в 2018 году. Если не произойдет прорыва в медицине, то к 2050 году число пациентов с этим заболеванием может увеличиться с 5,5 млн до 13,8 млн человек. Только в США примерно 14-20 человек из каждых 100000 страдают от миастении гравис, а всего насчитывается около 36000-60000 пациентов, что также является очень тревожной цифрой. Самая большая проблема с лекарствами, которые в настоящее время доступны на рынке для лечения болезни Альцгеймера и миастении гравис, - это токсичность и устойчивость к препаратам. По сравнению с существующими препаратами, гуперзин А - это натуральный растительный экстракт, обладающий хорошей безопасностью, меньшим количеством побочных реакций и быстро усваивающийся организмом человека. Метод ингибирования представляет собой смешанный тип конкурентного и неконкурентного ингибирования, а терапевтический эффект является значительным с длительным временем действия.
Криптомерия змеиная распространена по всему миру, но ее ресурсы очень ограничены. Одним из ограничивающих факторов является медленный рост криптомерии змеиной лапки, которой требуется не менее 15 лет от споры до зрелости. А в зрелой стадии высота змеиной лапки составляет всего 10-30 см. В то же время среду ее роста сложно воспроизвести и трудно внедрить в реальный процесс выращивания. Поэтому в ближайшем будущем пихта змеиная окажется под угрозой исчезновения. В последние годы было проведено множество исследований этого редкого растения, таких как выращивание эксплантов и каллусных тканей in vitro. Команда Канъитиро Ишиучи последовательно начала с H. Экспланты были получены из верхушки стебля пинии и культивировались в стерильной среде в течение 2 циклов (каждый цикл длится 7 дней). Наконец, экспланты были успешно перенесены в среду для выращивания каллуса. Кроме того, исследователи внесли различные усовершенствования в метод культивирования Huperzia serrata, такие как скрининг компонентов среды и исследование технологии культивирования верхушки стебля. Однако проблема дезинфекции и стерилизации эксплантов в процессе культуры тканей не была эффективно решена, что ограничивает крупномасштабное производство гуперзина А. В связи с нехваткой природных ресурсов и вышеупомянутыми причинами существует острая необходимость в поиске нового метода, способного увеличить содержание гуперзина А при меньших затратах.
Эндофитные грибы - это вид грибов, которые живут в тканях стеблей и листьев растений. Исследования показали, что если эндофитные грибы долгое время развиваются в симбиозе с растениями, они могут получить определенные гены растения-хозяина путем генетической рекомбинации, производя вторичные метаболиты, идентичные тем, что есть у растения-хозяина. Между тем, эндофитные грибы могут также вырабатывать гормоны, способствующие росту и развитию растений-хозяев. Поэтому в системе совместного культивирования эндофитные грибы рассматриваются как элиситоры, что означает, что растительные клетки могут совместно культивироваться с эндофитными грибами в определенном диапазоне концентраций. В системе совместного культивирования эндофитные грибы и растительные клетки взаимодействуют друг с другом, способствуя накоплению растительной продукции. Эргостерин является важным компонентом клеточной мембраны грибов и характерным стерином грибов. Он может быть использован в качестве репрезентативного индикатора для измерения биомассы грибов.
В данном исследовании представлена новая система совместного культивирования (CCS) для экономичного и удобного повышения содержания гуперзина А в пихте китайской, чтобы улучшить текущую ситуацию, когда пихта китайская не может быть широко использована из-за нехватки ресурсов.

Гуперзин А - это ингибитор АХЭ, применяемый для лечения болезни Альцгеймера и миастении гравис. Его основным источником является Cryptomeria lanceolata, но содержание Huperzine A в Cryptomeria lanceolata невелико, а ограниченность ресурсов Cryptomeria lanceolata ограничивает его дальнейшее развитие в фармацевтической области. Существуют исследования, показывающие, что на растениях обитают различные эндофитные грибы, которые в ходе длительной эволюции сформировали сложные мутуалистические отношения с растениями-хозяевами. С одной стороны, эндофитным грибам необходимо поглощать питательные вещества из растений для удовлетворения собственных потребностей в выживании. С другой стороны, эндофитные грибы вступают в особый биохимический обмен с растениями-хозяевами, чтобы противостоять защитной системе хозяина. Они могут синтезировать вторичные метаболиты, сходные с хозяином, распознавая его химические сигналы или используя ферментные системы хозяина. Цзян и др. выделили и очистили эндофитные грибы из полукрасного мангрового растения Hibiscus и получили те же вторичные метаболиты, что и хозяин, путем твердофазной ферментации. Тонг и др. выделили и изучили вторичные метаболиты эндофитного гриба FS4 в Cryptomeria serrata и обнаружили, что пять его метаболитов проявляют сильную ингибирующую ацетилхолинэстеразу биологическую активность, аналогичную активности гуперзина А.
В данном исследовании были проведены эксперименты по изучению условий одомашнивания и среды для культуры тканей дикого змеевидного болиголова. Оптимальными условиями культивирования были определены интенсивность освещения 100 люкс, влажность 95%, жидкая среда MS, сахароза 20,0 г/л, 2,4-D5,0 мг/л и KT1,0 мг/л. Относительные изменения двух соединений, гуперзина А и эргостерина, использовались для отражения динамического процесса роста CCS. Четвертый день был определен как оптимальное время для сбора урожая и субкультуры на основании точки перегиба. Через 4 дня культивирования CCS содержание гуперзина А увеличилось на 49,34%, достигнув максимального значения. Общее содержание гуперзина А в системе культивирования имело тенденцию сначала к увеличению, а затем к уменьшению. Это связано с тем, что на поздней стадии роста эндофитные грибы обладают более сильной репродуктивной способностью, чем способностью к дифференциации растительных клеток, конкурируя за питательные вещества и пространство для роста в культуральной среде, что приводит к уменьшению количества клеток. Поэтому выбор времени сбора и субкультуры является ключевым фактором для достижения постепенного обогащения гуперзина А в системе совместного культивирования. В то же время концентрация растительного гормона 2,4-D оказывает значительное влияние на систему. 2,4-D способствует дедифференциации органов растений и индукции каллусной ткани, но при слишком высокой концентрации оказывает ингибирующее действие на дифференциацию клеток. Поэтому в системе культивирования 5 мг/л используется в качестве оптимальной концентрации. В данном эксперименте успешно использовалась система совместного культивирования для достижения биосинтеза гуперзина А. Этот метод преодолевает традиционные фиксированные представления, поскольку культура соматических клеток растений не требует предварительной тщательной стерилизации. Соматические клетки растений и эндофитные грибы могут культивироваться совместно, и производство гуперзина А может быть стимулировано при определенных соотношениях. При условии точного соблюдения цикла культивирования этот удобный и быстрый метод может быть использован для накопления гуперзина А, что имеет большое значение для защиты растительных ресурсов и обогащения важных биологически активных веществ гуперзина А.