Получение γ - полиглутаминовой кислоты и исследование ее ингибирующей активности в отношении тирозиназы
Полимеры, такие как гомополимеры аминокислот, обладают широким спектром биологических функций, биосовместимостью и дисперсным молекулярно-массовым распределением. В настоящее время гомополимеры аминокислот, полученные с помощью микроорганизмов, в основном включают три типа: полиглутаминовую кислоту (поли- γ - глутаминовая кислота, γ - PGA), ε - поли-лизин (ε - PL) и цианофицин. Гамма-ПГА, как один из них, также обладает прекрасными биологическими характеристиками. Начиная с 1913 года, исследователи последовательно выделяли гамма-ПГА из слизи пищевого продукта натто и сред ферментации Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. megaterium и B. anthracis. Конформационная структура γ - ПГА значительно изменяется в зависимости от значения рН, концентрации и ионной силы раствора. При производстве γ-ПГА Bacillus subtilis наблюдаются параллельные β-складчатые структуры в кислых растворах, нерегулярные свернутые структуры при приближении к нейтральной среде и случайные вытянутые структуры в щелочных средах.

Готовый продукт γ - PGA представляет собой белый порошок без запаха с молекулярной массой от 100 до 10000 кДа, что эквивалентно примерно 50-50000 мономерам глутаминовой кислоты. Гамма-ПГА и его производные имеют широкие перспективы исследования и применения во многих областях. Например, они используются в качестве пищевого консерванта, увлажняющего компонента в косметике, носителя лекарств с замедленным высвобождением, адсорбента тяжелых металлов и флокулянта для очистки воды. В 2013 году исследователи обнаружили, что гамма-ПГА снижает уровень реактивных видов кислорода и оксида азота в клетках B16, повышает активность каталазы, а также ингибирует активность тирозиназы, индуцированной форсклином, и выработку меланина. Это первое сообщение о противомеланогенном действии γ - ПГА.

Молекулярная масса является важным характеристическим параметром полимеров, и ее размер определяет область применения и эффективность. Поэтому очень важно получить различные молекулярные веса гамма-ПГА и изучить различия в активности между разными молекулярными весами, чтобы расширить область применения гамма-ПГА. В настоящее время микробная ферментация является широко используемым методом для ферментации гамма-ПГА. Молекулярная масса и выход γ - ПГА, полученного этим методом, зависят от бактерий-производителей. В зависимости от того, добавляется ли глутаминовая кислота в процессе ферментации, производственные штаммы γ - ПГА делятся на две категории: штаммы, зависящие от глутаминовой кислоты, и штаммы, не зависящие от глутаминовой кислоты. Исследования показали, что использование глутамат-зависимых штаммов в качестве бактерий-продуцентов приводит к более высокому производству гамма-ПГА. Поэтому в данной статье для получения γ - ПГА путем микробной ферментации используется штамм Bacillus subtilis. Пять групп различных молекулярных масс γ - ПГА были получены путем комбинирования методов химической деградации, и было изучено их внутриклеточное и внеклеточное ингибирование активности тирозиназы. Заложить основу для применения различных молекулярных весов гамма-ПГА в качестве отбеливающих агентов в области косметики.

Гамма-ПГА является внеклеточным секретируемым продуктом. В течение длительного времени проводились обширные исследования его свойств, бактериальных улучшений и генетических характеристик, процесса ферментации, а также выделения и очистки. Молекулярная масса γ - PGA напрямую влияет на его применение во многих областях. После того как исследователи обнаружили, что гамма-ПГА обладает антимеланиновым действием, гамма-ПГА постепенно стал потенциальным ингредиентом для отбеливающих средств.
Снижение выработки меланина - ключевой шаг в достижении отбеливающего эффекта. Накопленные исследования показали, что тирозиназа является важным лимитирующим ферментом, участвующим в процессе производства меланина, а уровень ее экспрессии и активность определяют скорость и выход синтеза меланина. Поэтому ее ингибиторы обычно используются в качестве отбеливающих агентов. В 2004 году Сасаки и др. обнаружили, что металлотионеин может эффективно подавлять выработку меланина, стимулируемую NO и другими меланогенами, путем прямого ингибирования активности тирозиназы в меланосомах. В 2013 году Джеонг и др. обнаружили, что агликон гинзенозида Rh4 (A-Rh4) ингибирует синтез меланина в клетках меланомы B16 через путь протеинкиназы А. При синтезе меланина наблюдалось повышение активности тирозиназы, а ее снижение может подавлять выработку меланина. Поэтому поиск природных биоматериалов с антитирозиназной активностью рассматривается как важная стратегия разработки новых средств для регулирования пигментации кожи.
В данной статье в качестве штамма для ферментативного получения γ - ПГА выбран штамм Bacillus subtilis, зависимый от глутаминовой кислоты, с выходом 8 г/л и содержанием 97,69%. Используя чувствительность структуры к физико-химическим условиям и комбинируя методы химической деградации, было получено пять различных молекулярных масс γ - ПГА со средневзвешенными молекулярными массами 21, 117, 282, 432 и 501 кДа. Для обеспечения биологической безопасности клеток сначала был оценен безопасный диапазон концентраций, который могут использовать клетки. Затем в качестве показателя для определения скорости ингибирования активности тирозиназы пятью различными молекулярными массами γ - PGA внутри и вне клетки использовали скорость ингибирования активности тирозиназы. Комплексные результаты цитотоксичности и активности ингибирования тирозиназы показали, что все пять молекулярных весов γ - PGA обладают активностью ингибирования тирозиназы, а внеклеточная активность ингибирования тирозиназы увеличивается с увеличением молекулярного веса, что создает теоретическую основу для будущего применения γ - PGA в качестве потенциального отбеливающего ингредиента.
Молекулярная масса γ - ПГА, полученного методом микробной ферментации, ограничена. Цзян и др. сконструировали рекомбинантную Bacillus subtilis, содержащую кластер генов фермента деградации γ - ПГА pgsBAE, который может синтезировать низкомолекулярный (около 10 кДа) γ - ПГА. Цяо Чаншэн и др. использовали ферментационный резервуар для ферментации и получили 1000 кДа γ - PGA, регулируя процесс ферментации и оптимизируя условия ферментации. Поэтому следующим шагом будет сочетание генной инженерии и других методов для создания инженерных штаммов путем введения ключевых фрагментов генов ферментов деградации или ферментов синтеза для получения более или менее молекулярной массы гамма-ПГА, с целью дальнейшего изучения его отбеливающей активности.
В настоящее время в качестве отбеливающих агентов в косметические формулы добавляются натуральные ингредиенты, в том числе кверцетин, арбутин, ниацинамид, астаксантин, салициловая кислота, фруктовая кислота и др. Различные отбеливающие ингредиенты обладают разной отбеливающей активностью благодаря различным механизмам отбеливания. Один и тот же отбеливающий ингредиент также оказывает различное действие в косметике из-за его различных концентраций. Таким образом, изучение отбеливающей активности полиглутаминовой кислоты с разным молекулярным весом позволяет не только создать потенциальный отбеливающий ингредиент для косметики, но и добавлять его в косметические формулы для оказания различных эффектов на основе различий в отбеливающей активности между разными молекулярными весами, адаптируясь к различным группам населения и удовлетворяя их потребности в отбеливании. В будущем, совершенствуя технологию извлечения природных экстрактов, можно будет проводить качественный и количественный анализ активных ингредиентов в экстрактах, чтобы определить их действие и найти активные вещества с наилучшим отбеливающим эффектом в природных организмах.